腫瘤歸巢穿膜肽介導(dǎo)靶向載藥相變納米粒用于乳腺癌體外超聲分子成像與治療研究.pdf

1、第一部分腫瘤歸巢穿膜肽合成及體外活性研究
　　目的：采用固相法人工合成異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的新型腫瘤歸巢穿膜肽tLyP-1(CGNKRTR)，并于體外檢測其腫瘤靶向性及穿膜特性。
　　方法：采用Na-芴甲氧羰基(Fmoc)法固相合成tLyP-1，并用 FITC標記N端。高效液相色譜及質(zhì)譜儀檢測其純度及分子量；激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀觀察其腫瘤靶向性及穿膜能

2、力；建立三維腫瘤球模型檢測其靶向穿膜性；CCK8（cell counting kit-8)評價其細胞毒性。
　　結(jié)果：合成的FITC-tLyP-1純度為99.14%，分子量為1334.7；激光共聚焦顯微鏡可見FITC-tLyP-1能靶向聚集到MDA-MB-231細胞膜周圍并部分穿膜進入到細胞內(nèi)，而在 HUVEC細胞膜周圍未見明顯的聚集和穿膜現(xiàn)象；流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞內(nèi)熒光強度值高于HUVEC；FITC-tLyP-

3、1可穿入MDA-MB-231三維腫瘤球模型內(nèi)部約120μm；CCK8檢測不同濃度的FITC-tLyP-1對細胞活性沒有明顯影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論：采用固相法成功合成 FITC標記的新型腫瘤歸巢穿膜肽tLyP-1，具有乳腺癌MDA-MB-231腫瘤靶向性和穿膜性，能作為一種潛在的腫瘤靶向藥物運輸載體。
　　第二部分腫瘤歸巢穿膜肽介導(dǎo)的靶向載藥相變納米粒制備及體外靶向性、穿膜性研究
　　目的：制備一種新型超聲分子

4、探針--腫瘤歸巢穿膜肽 tLyP-1介導(dǎo)的靶向載10-羥基喜樹堿（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），檢測其基本表征，并評價其體外靶向性及穿膜性。
　　方法：薄膜水化-聲振法制備新型超聲分子探針，檢測其形態(tài)、分布、粒徑及表面電位；激光共聚焦顯微鏡定性觀察、流式細胞儀定量分析其體外靶向性和細胞穿膜性；建立三維腫瘤球模型檢測納米粒的靶向穿膜性。
　　結(jié)果： tLyP

5、-1-10-HCPT-PFP NPs大小均一、分散性好，粒徑為（366.30±11.50)nm，表面電位為（5.70±3.70）mV；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs可靶向聚集到MDA-MB-231細胞膜周圍且部分穿膜進入到細胞質(zhì)內(nèi)，而 HUVEC細胞膜周圍未見明顯聚集和穿膜現(xiàn)象；無 tLyP-1肽介導(dǎo)的非靶向載藥相變納米粒（10-HCPT-PFP NPs）在兩種細胞周圍也未見明顯聚集和穿膜現(xiàn)象；流式

6、細胞儀結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞內(nèi)tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs的熒光強度明顯高于其余各組（P＜0.05）；MDA-MB-231三維腫瘤球模型的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示 tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs可穿入MDA-MB-231三維腫瘤球內(nèi)部約80μm，而10-HCPT-PFP NPs在腫瘤球模型表面未見明顯聚集，同時僅見極少量的納米粒進入到腫瘤球內(nèi)部，且距離僅約25μm。
　　結(jié)論：成功制備了腫瘤

7、歸巢穿膜肽 tLyP-1介導(dǎo)的靶向載10-羥基喜樹堿（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），其能有效地靶向乳腺癌 MDA-MB-231細胞并穿膜進入細胞質(zhì)內(nèi)及腫瘤球內(nèi)部，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分腫瘤歸巢穿膜肽介導(dǎo)的靶向載藥相變納米粒體外超聲成像及靶向治療研究
　　目的：制備一種新型超聲分子探針--腫瘤歸巢穿膜肽 tLyP-1介導(dǎo)的靶向載10-羥基喜樹堿

8、（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），評價其體外超聲成像及對乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外治療效果。
　　方法：高效液相色譜儀檢測所制備納米粒10-HCPT的包封率及載藥率；加熱板加熱和低強度聚焦超聲儀（low intensity focused ultrasound，LIFU）輻照后觀察納米粒液氣相變及體外超聲成像效果；流式細胞儀檢測納米粒對 MDA-MB-2

9、31細胞早晚期凋亡影響，CCK8檢測納米粒對MDA-MB-231細胞毒性作用。
　　結(jié)果：本實驗制備的tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs中10HCPT的包封率為86.04±4.27%，載藥率為7.82±0.38%。tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs加熱到45℃可致相變，此外一定功率的LIFU輻照后也可致相變并能增強超聲成像（P＜0.05）；tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs聯(lián)合LIFU輻照后，MDA-