NGR介導(dǎo)腫瘤血管靶向載基因納米粒的研究.pdf

1、本文以NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸,asparagines-glycine-arginine)肽為靶向因子,構(gòu)建NGR肽修飾的靶向載基因自組裝納米粒。NGR肽可靶向腫瘤新生血管上皮細(xì)胞特異過量表達(dá)的CD13受體,因此,我們構(gòu)建的這一新型載基因自組裝納米粒能夠主動靶向到腫瘤新生血管,實(shí)現(xiàn)靶向傳送目的基因,實(shí)現(xiàn)抗腫瘤血管生成基因治療的目的。
　　 除主動靶向功能外,理想的基因載體應(yīng)具備高的基因裝載率,低毒,控制基因釋放等功能。以

2、聚乳酸-聚乙二醇PLA-PEG為載體材料,以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)?；?pEGFP)作為報(bào)告基因,以自主合成新型陽離子類脂十二烷酸6-(2,6-二氨基-己酰氧基)己酯(6-lauroxyhexyllysinate,LHLN)作為電荷調(diào)節(jié)劑,采用自組裝技術(shù)制備高裝載率荷基因納米粒,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行NGR肽修飾,以探索理想的非病毒基因載體的構(gòu)建方法。實(shí)驗(yàn)所選基因載體材料均生物相容；PEG可增加載體材料親水性和柔順性,提高DNA裝載率,同時(shí)

3、避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；納米粒表面連接NGR肽,特異結(jié)合腫瘤新生血管上皮細(xì)胞過度表達(dá)的CD13受體,從而起到主動靶向和增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染效率的作用。通過研究NGR-CD13靶向結(jié)合及其介導(dǎo)的納米粒內(nèi)在化過程,探索外源基因靶向進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制；在基因靶向治療納米載體及其靶向機(jī)制研究上取得一定進(jìn)展,為腫瘤的抗血管生成基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。課題主要研究方法與結(jié)果如下:
　　 1LHLN修飾陽離子PLA-PEG載基因納

4、米粒的研究在兩親性嵌段共聚物納米粒處方中引入陽離子類脂作為電荷調(diào)節(jié)劑來制備陽離子納米粒是促進(jìn)非病毒基因載體基因轉(zhuǎn)染的主要手段。鑒于常用的單鏈陽離子類脂如CTAB和CPC具有較高的細(xì)胞毒性,本文利用本實(shí)驗(yàn)室自行合成的新型單鏈陽離子類脂LHLN并用于載基因PLA-PEG納米粒的修飾,研究新型陽離子類脂LHLN修飾后促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的效果。
　　 采用改良溶劑擴(kuò)散法,以LHLN為電荷調(diào)節(jié)劑制備陽離子型PLA-PEG納米粒,與報(bào)告基因pEG

5、FP復(fù)合后得到載基因PLA-PEG納米粒(PLA-PEGNPs/pDNA),分別對其相關(guān)理化性質(zhì),細(xì)胞毒性,體外釋放特性,抗核酸酶降解的能力以及血漿穩(wěn)定性進(jìn)行考察。通過體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對復(fù)合物在HeLa細(xì)胞,A549細(xì)胞,HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行初步評價(jià)。所制備的新型空白PLA-PEG納米粒和PLA-PEGNPs/pDNA復(fù)合物均呈球形或類球形,平均粒徑分別為122.3±5.3nm和164.2±2.5nm；粒徑多分散指數(shù)分別為0.

6、223和0.288；Zeta電位分別為+24.0±6.8mV和+11.9±2.9mV。所制備的PLA-PEGNPs/pDNA結(jié)合緊密,具有較強(qiáng)的抗核酸酶能力。體外釋放藥物達(dá)20天,前期突釋過程很明顯,48h內(nèi)累計(jì)釋放量達(dá)80.8％。24h至20d,釋藥過程非常緩慢,至20d時(shí),累計(jì)釋放量達(dá)到94.6％,認(rèn)為基本釋放完全。釋放行為符合雙向動力學(xué)方程:100-Q=90.22e-0.0735+22.04e-0.0034(ra=0.9822,r

7、b=0.9796)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,在轉(zhuǎn)染劑量下,與CTABPLA-PEGNPs/pDNA以及Lipofectamine相比,PLA-PEGNPs/pDNAs具有較低的細(xì)胞毒性(p<0.05)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PLA-PEGNPs/pDNAs具有較高的轉(zhuǎn)染效率,在試驗(yàn)的各種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率均具有PLA-PEGNPs/pDNA>Lipofectamine>CTABPLA-PEGNPs/pDNA>裸DNA的趨勢。因此,LHLN是一種應(yīng)用前

8、景廣泛,毒性小,體外轉(zhuǎn)染效率高的新型陽離子類脂,可用于促進(jìn)納米粒的體外基因轉(zhuǎn)染效率。用其修飾的PLA-PEGNPs/pDNA,制備工藝簡單,毒性低,轉(zhuǎn)染效率高,具有一定開發(fā)前景。
　　 2NGR靶向陽離子型PLA-PEG納米粒的研究抗腫瘤血管生成基因治療是一種很有效的抗血管生成方法,采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將治療基因運(yùn)送到新生血管內(nèi)皮細(xì)胞并使其高效表達(dá),以自分泌和旁分泌的形式抑制腫瘤血管生成,可在腫瘤局部達(dá)到穩(wěn)定長效的作用。近年來研究表

9、明,含NGR序列的小肽可特異靶向腫瘤血管上皮細(xì)胞CD13受體,并且環(huán)狀NGR肽比線性NGR肽更具優(yōu)勢。
　　 本文設(shè)計(jì)和合成了具有血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向功能的環(huán)六肽CNGRCG(cNGR),并以其為靶向因子與載體材料PLA-PEG耦合(cNGR-PLA-PEG),制備cNGR修飾PLA-PEG納米粒(cNGR-PLA-PEGNPs)。靜電復(fù)合綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因制備載基因納米粒。分別對其相關(guān)理化性質(zhì),體外釋放特性,抗核酸酶降解的

10、能力以及血漿穩(wěn)定性進(jìn)行考察。與普通PLA-PEG納米粒(PLA-PEGNPs)對比,通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對復(fù)合物在HUVEC細(xì)胞,A549細(xì)胞,HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行初步評價(jià)。
　　 結(jié)果,通過EDC/NHS法合成得到cNGR-PLA-PEG,核磁共振(1HNMR)和紅外(IR)驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)正確性。所制備cNGR-PLA-PEGNPs和cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA復(fù)合物均呈球形或類球形

11、,平均粒徑分別為139.5±7.9nm和171.9±3.9nm；粒徑多分散指數(shù)分別0.290和0.167；Zeta電位分別為+22.14±1.88mV和+10.7±4.5mV。cNGR-PLA-PEGNPs表面cNGR修飾率達(dá)9.77±1.32％。所制備的cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA結(jié)合緊密,具有較強(qiáng)的抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,cNGR-PLA-PEGNPs/DNA釋放行為符合雙向動力學(xué)方程:100-Q

12、=83.93e-0.081t+18.47e-0.004t(ra=0.9899,rb=0.9874)。釋藥全過程包括快速釋放(0-12h)和緩慢釋放(24h-20d)兩個(gè)階段。前48h突釋明顯,累計(jì)釋放量達(dá)84.9％。24h至20d,釋藥過程非常緩慢,至20d時(shí),累計(jì)釋放量達(dá)到98.2％,釋放完全。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,在轉(zhuǎn)染劑量下,Lipofectamine相比,cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA具有較低的細(xì)胞毒性(p<0.05)。轉(zhuǎn)

13、染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在CD13表達(dá)陽性細(xì)胞中,cNGR-PLA-PEGNPs明顯高于在PLA-PEGNPs/pDNA,而在CD13表達(dá)陰性HepG2細(xì)胞中,cNGR-PLA-PEGNPs的轉(zhuǎn)染效率與PLA-PEGNPs/pDNAs沒有顯著差異(p>0.05)。因此,cNGR-PLA-PEGNPs具有較高的體外靶向性和轉(zhuǎn)染效率,有望成為一種高效的、能將治療基因靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤新生血管部位的納米載體。
　　 3NGR介導(dǎo)靶向載基因PLA-

14、PEG納米粒入胞機(jī)制研究本文采用免疫熒光示蹤及流式細(xì)胞技術(shù)對受體介導(dǎo)基因載體的體外靶向性和與細(xì)胞相互作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,以期在闡明機(jī)制的基礎(chǔ)上為基因載體構(gòu)建指明方向。
　　 采用摻和熒光標(biāo)記載體材料的方法分別制備熒光標(biāo)記的cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs并考察其理化性質(zhì)。通過免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)對CD13表達(dá)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選。通過倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)評價(jià)cNGR-PLA-PEGNPs和PLA

15、-PEGNPs的體外攝取特征和在不同細(xì)胞中入胞機(jī)制。結(jié)果表明,所制備的熒光標(biāo)記cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs均呈表面光滑圓整的球形,粒徑分別為149.6±8.4nm和136.9±4.5nm,多分散指數(shù)為0.247和0.183；納米粒的Zeta電位分別為+17.2±3.9和+19.54±2.3。熒光材料FITC-PLA-PEG的摻入不對納米粒的理化性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。因此,可以用熒光標(biāo)記納米粒來研究納米粒本身的特性與功

16、能。細(xì)胞表面CD13受體表達(dá)量的順序?yàn)?HUVEC>A549>HCT116>HepG2。選擇CD13陽性率最高的HUVEC細(xì)胞和CD13陰性HepG2細(xì)胞用于進(jìn)一步的研究。納米粒體外攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,納米粒入胞為時(shí)間、濃度依賴性過程,并受低溫和代謝抑制劑的影響,cNGR-PLA-PEGNPs更容易進(jìn)入HUVEC細(xì)胞。競爭抑制中,游離cNGR與cNGR-PLA-PEGNPs競爭細(xì)胞表面CD13受體,抑制細(xì)胞對其攝取,表明cNGR-PLA-

17、PEGNPs通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞途徑入胞。進(jìn)一步的內(nèi)吞抑制劑實(shí)驗(yàn)表明,cNGR-PLA-PEGNPs進(jìn)入HUVEC細(xì)胞為籠形蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)相結(jié)合的機(jī)制,但以小窩蛋白介導(dǎo)為主,另外還涉及到少量程度的液相內(nèi)吞。PLA-PEGNPs進(jìn)入HUVEC細(xì)胞以巨胞飲途徑為主,伴有少量程度的籠形蛋白介導(dǎo)途徑。cNGR-PLA-PEGNPs進(jìn)入HepG2細(xì)胞以小窩蛋白介導(dǎo)途徑為主,伴有少量程度的液相內(nèi)吞。PLA-PEGNPs進(jìn)入HepG2細(xì)胞主要涉及小窩

18、蛋白介導(dǎo)途徑和巨型胞飲途徑兩種機(jī)制,還有少量程度的液相內(nèi)吞,但以巨型胞飲途徑為主。由此可見,納米粒類型和細(xì)胞類型均對納米粒的入胞途徑有著重要的影響。
　　 綜上所述,本文制備的NGR介導(dǎo)靶向載基因PLA-PEG納米粒對DNA保護(hù)作用強(qiáng),所載DNA能夠從載體中緩慢釋放,細(xì)胞耐受性良好,具有較高的體外靶向性和轉(zhuǎn)染效率,其入胞機(jī)制涉及籠形蛋白介導(dǎo)和小窩蛋白介導(dǎo)兩種途徑。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究影響基因載體細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)的關(guān)鍵因素,從而對其載體