CD147單抗介導(dǎo)的α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒的制備及其肝腫瘤靶向性研究.pdf

1、目的:以殼聚糖(Chitosan,CS)為載體,以水難溶性藥物α-常春藤皂苷(α-Hederin,α-Hed)為模型藥物,制備α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-NP,αHCS),再以肝腫瘤細(xì)胞表面高度表達的CD147單抗為靶頭,將其偶聯(lián)修飾于納米粒表面制備CD147介導(dǎo)的α-常春藤皂苷殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-CD147-NP,αHCD),從而通過納米粒的緩釋效果和單抗介導(dǎo)的主動靶向性達到減毒增效的作用。
　　方

2、法:(1)以平均粒徑、多分散指數(shù)(Polydisperse Index,P.I.)和包封率(Entrapment Efficiency,EE)為綜合指標(biāo),采用乳化-溶劑擴散法制備αHCS,并采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計,考察納米粒處方和制備工藝。紅外(FT-IR)、X射線衍射(XRD)、差示掃描量熱分析(DSC)等對αHCS納米粒進行表征,同時系統(tǒng)考察納米粒的體外釋放行為及其相關(guān)藥劑學(xué)性質(zhì)。(2)采用EDC/NHS酰胺化反應(yīng)制備αHCD

3、,并對納米粒進行粒徑測定、FT-IR和XRD表征;采用BCA試劑盒和ELISA法分別建立CD147單抗的含量和活性測定方法;依據(jù)HepG2細(xì)胞對不同單抗修飾量納米粒的攝取結(jié)果,選擇合適的單抗修飾量。(3)以未載藥的CD147單抗介導(dǎo)的殼聚糖納米粒(Void CS-CD147-NP,VCD)為對照,MTT法考察CD147單抗對肝腫瘤細(xì)胞活性的抑制作用、α-Hed及其納米粒對HepG2、SMMC-7721、HSC的細(xì)胞毒作用;采用流式細(xì)胞術(shù)

4、檢測原料藥及其納米粒對HepG2細(xì)胞的凋亡效果和對其細(xì)胞周期的影響。(4)流式細(xì)胞術(shù)方式考察HepG2在2h和24h內(nèi)αHCS和αHCD的攝取率,HSC細(xì)胞作為對照細(xì)胞考察兩種納米粒的攝取差異性,并通過加入過飽和CD147進行納米粒的競爭性抑制試驗;多種細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑對兩種納米粒的攝取機制進行探討,并考察兩種納米粒在體內(nèi)的攝取分布過程。(5)分別以生理鹽水組為陰性對照,環(huán)磷酰胺為陽性對照,HepG2細(xì)胞裸鼠腫瘤模型腹腔注射給予α-Hed

5、及其納米粒后,考察其體內(nèi)藥效學(xué);采用小動物活體成像技術(shù),動態(tài)考察納米粒在荷HepG2細(xì)胞裸鼠體內(nèi)的組織分布及其腫瘤靶向性。
　　結(jié)果:(1)乳化溶劑擴散法制備的αHCS納米粒粒徑分布均勻,平均粒徑(92.7±2.77)nm,P.I.(0.134±0.036),包封率(75.63±4.06)％;透射電鏡觀察納米粒外觀形態(tài)圓整;FT-IR、XRD、DSC表征結(jié)果表明藥物已分散于殼聚糖納米粒中;體外釋放顯示殼聚糖納米粒具有一定的緩釋特性

6、。(2)CD147能通過酰胺反應(yīng)偶聯(lián)修飾到αHCS表面;與αHCS的粒徑相比,αHCD的粒徑變化較小;偶聯(lián)所得αHCS中CD147單抗飽和修飾量為(6.55±0.234)μg/mgNP,結(jié)合不同修飾量對納米粒攝取結(jié)果影響、單抗的活性和過多修飾量可能產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)等因素,本實驗最終確定修飾量為1.5μg/mgNP,且單抗活性保留率為(57.07±0.60)％。(3)MTT實驗結(jié)果表明未載藥單抗修飾的殼聚糖納米粒VCD及本實驗所用CD1

7、47單抗修飾量均對肝腫瘤細(xì)胞無細(xì)胞毒作用,原料藥及其納米粒對HepG2、SMMC-7721的IC50值為αHCD<αHCS<α-Hed,以HSC細(xì)胞為對照,提示與單抗介導(dǎo)的主動靶向性有關(guān);通過細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果與HepG2細(xì)胞MTT實驗相一致;在細(xì)胞周期實驗中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在S期的百分比有所增加。(4)HepG2細(xì)胞對納米粒攝取具有時間依賴性,且αHCD的攝取明顯高于αHCS,另外HSC對兩種納米粒攝取無差異,結(jié)合過飽和競爭抑制實驗中αHCD攝

8、取率明顯下降,說明αHCD納米粒對肝腫瘤細(xì)胞具有更好的親和性;從攝取抑制劑實驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)載藥納米粒的內(nèi)吞攝取過程屬于能量依賴型,需通過形成有被小窩內(nèi)陷和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進入細(xì)胞,且與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和流動性息息相關(guān)。倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示納米粒1h時大多聚集在細(xì)胞膜表面,3h時細(xì)胞攝入納米粒明顯增多。(5)體內(nèi)藥效學(xué)實驗中,αHCS(79.02％)和αHCD(88.43％)納米粒的抑瘤率遠(yuǎn)高于原料藥中劑量組(53.83％);納米粒組抑

9、瘤率均在70％以上,且存在劑量依賴性。近紅外熒光成像實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),尾靜脈給藥1h后,兩種納米粒在腫瘤部位和肝臟可見較為集中的熒光分布,在6h時,腫瘤部位熒光強度有所減弱,12h后納米粒熒光開始減弱。
　　結(jié)論:乳化溶劑擴散法制備的αHCS大小分布均勻、外觀形態(tài)圓整、包封率高,有緩釋特性,體外體內(nèi)藥效學(xué)實驗表明空白納米粒與細(xì)胞具有生物相容性,αHCD對肝腫瘤細(xì)胞的毒副作用的增強和肝腫瘤細(xì)胞對該納米粒攝取的增多與CD147單抗介導(dǎo)的主