蛙皮素樣肽t-BBN介導的金磁納米粒對乳腺癌MRI-CT靶向成像研究.pdf

1、目的:
　　1.采用兩種不同的方法制備具有多核結(jié)構(gòu)的納米團簇，研究不同方法制備出來的納米團簇的理化性能，篩選出一種具有超順磁性、橫向弛豫效能高、粒徑可控且分布均勻的磁性納米材料;
　　2.通過種子生長的方法制備出具有不同金殼厚度的Fe3O4@Au納米粒，研究不同金殼層厚度對納米粒橫向弛豫效能和X線衰減效能的影響，制備出一種適合磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)/X射線計算機斷層成像（C

2、omputed tomography, CT）雙模態(tài)成像的對比劑;
　　3.在Fe3O4@Au納米粒表面偶聯(lián)多肽t-BBN，制備胃泌素釋放肽受體靶向的分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN，研究基于該探針對乳腺癌進行MRI/CT雙模態(tài)成像的可行性。
　　方法:
　　1.具有多核結(jié)構(gòu)磁性納米團簇的合成及表征:在惰性氣體的保護下，以油酸、油胺為表面活性劑，1，2-十六烷二醇為還原劑，在高溫環(huán)境中分解乙酰丙酮鐵得到疏水性F

3、e3O4納米粒，用四甲基氫氧化銨（tetramethylammonium hydroxide，TMAH）對其進行表面改性，使其具有水溶性。用兩親性表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)對疏水性Fe3O4進行表面修飾，使其在水性溶液中自組裝成具有多個磁性內(nèi)核的膠束結(jié)構(gòu)。同時，在氮氣的保護下，以二乙二醇(diethylene glycol，DEG)為還原劑，F(xiàn)eCl3為前驅(qū)物，通過高溫水解法一鍋合成

4、具有多個磁性內(nèi)核的納米簇。對合成的3種納米粒進行理化性質(zhì)表征，包括用透射電子顯微鏡觀測納米粒的粒徑和形態(tài)、高分辨率透射電鏡觀測納米粒的晶格條紋、能譜儀和電感耦合等離子發(fā)射光譜儀檢測納米粒的元素組成、Zeta電位儀測量納米粒的Zeta電位、動態(tài)光散射測量納米粒的水合粒徑、振動樣品磁強計檢測納米粒的飽和磁化強度（saturation magnetization，Mp）和磁滯回線、MRI掃描檢測納米粒的橫向弛豫效能(transverse re

5、laxivity，r2)。
　　2.Fe3O4@Au納米粒的合成:通過Stober法在納米粒表面包覆一層薄薄的SiO2層，然后通過3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)的修飾，使納米粒表面帶上氨基基團。以硼氫化鈉為還原劑，還原氯金酸溶液得到粒徑為2-3 nm的金種子。通過金和氨基之間的配位作用將金種納米粒吸附在磁性納米核的表面，然后通過種子生長的方法長成完整的金殼層。通過加

6、入不同量的生長溶液得到具有不同金殼厚度的復合納米粒。對具有不同金殼層厚度的Fe3O4@Au納米粒進行理化性質(zhì)的表征，包括透射電鏡觀察納米粒的形貌、粒徑及化學成分、UV-Vis測定不同金殼層厚度復合納米粒的吸收光譜、Zeta激光粒度儀檢測納米粒的水化粒徑、振動樣品磁強計檢測納米粒的Mp和磁滯回線、CT和MRI掃描檢測納米粒的納米粒的X線吸收效能和r2。
　　3.Fe3O4@Au-PEG-BBN探針的構(gòu)建及其對乳腺癌細胞T-47D的體

7、外標記:參照序列QWAVGHLM合成修飾有巰基化PEG鏈的多肽HS-PEG-t-BBN，利用金與巰基之間的配位作用將多肽分子連接到復合納米粒的表面，制備出胃泌素釋放肽受體靶向的分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。以人乳腺癌細胞MDA-MB-231和T47-D為模型細胞，用CCK-8試劑盒檢測納米探針的細胞毒性，通過普魯士藍染色和透射電子顯微鏡觀察探針對T47-D細胞的特異性標記及其在細胞內(nèi)的亞細胞定位。
　　4.Fe3O4@

8、Au-PEG-BBN納米粒對乳腺癌靶向MRI/CT雙模態(tài)成像研究:用Fe3O4@Au-PEG-BBN探針對處于生長對數(shù)期的MDA-MB-231和T47D乳腺癌細胞進行體外標記，并對標記細胞進行MR和CT雙模態(tài)成像，體外檢測納米探針對T47-D的靶向成像作用。將T47-D和MDA-MB-231兩種細胞移植到裸鼠皮下，建立人乳腺癌的移植瘤動物模型。將探針通過尾靜脈引入體內(nèi)，取不同時間點對腫瘤進行MRI和CT成像，探討探針在體對人乳腺癌T47

9、-D的靶向成像作用。
　　結(jié)果:
　　1.通過高溫分解法成功合成疏水性Fe3O4納米粒，納米粒為球形，形貌規(guī)則且粒徑分布很窄，其平均粒徑為7.8±0.8 nm。通過SDS的表面修飾，納米粒成功自組裝呈具有多個磁性內(nèi)核的納米膠束，其平均粒徑為145±13 nm。通過高溫水解一鍋法成功合成Fe3O4納米粒團簇，粒徑分布均勻，其平均粒徑為110±10 nm。高分辨電鏡結(jié)果顯示2種納米粒的晶格條紋類似，其晶格條紋間距均和Fe3O4標

10、準晶面間距吻合較好，證明合成的2種納米粒均為Fe3O4納米粒。選區(qū)衍射結(jié)果顯示兩者的衍射花樣均呈同心圓樣，且極其相似，通過衍射環(huán)間距計算出的納米粒晶面間距和數(shù)據(jù)庫中Fe3O4的較為吻合。納米粒的能譜分析顯示納米粒中主要含有Fe和O這兩種化學元素。XRD測量結(jié)果顯示合成納米粒具有較好的結(jié)晶性，且和Fe3O4的標準X射線衍射譜吻合較好。3種納米粒的水化粒徑依次為9.7±1.2 nm、164±18 nm和123±13nm，在水溶液中均呈負電性

11、，其Zeta電位依次為-45.2 mV、-52.3 mV和-55.1 mV。測量3種納米粒的Mp后發(fā)現(xiàn)三者均具有超順磁性，Mp較相近，依次為71 emu g-1、69 emu g-1、65 emu g-1，接近塊體Fe3O4的Mp。但是相對于單個Fe3O4納米粒，具有多核結(jié)構(gòu)的磁性納米粒的r2顯著升高，三者的r2分別為67 mM-1S-1、256 mM-1S-1和245 mM-1S-1。
　　2.以高溫水解法合成的納米團簇為磁核，

12、成功通過Stober法在其外表面包被一層SiO2，并進行氨基化修飾。合成出粒徑為3.2 nm的金種顆粒，并成功將其偶聯(lián)在磁核表面。依次加入不同量的生長溶液，得到具有不同金殼成厚度的復合納米粒。加入10、20和30 mL生長溶液得到的復合納米粒的粒徑依次為118±12nm(Fe3O4@Au-10)、125±13nm（Fe3O4@Au-20）和130±11 nm(Fe3O4@Au-30)。UV-Vis吸收光譜測定顯示不同厚度金殼層的吸收峰的

13、位置不同，3.2 nm金種納米粒的吸收峰在520nm波長處。隨著加入生長溶液的增多，復合納米粒的吸收峰逐漸紅移。隨著金殼層厚度的增加，納米粒的Mp逐漸從63 emu g-1下降到32.5 emu g-1，r2也相應地從235 mM-1S-1下降到168 mM-1S-1。相反，隨著金殼層厚度的增加，復合納米粒的X射線衰減能力逐漸增強，F(xiàn)e3O4@Au-10、Fe3O4@Au-20和Fe3O4@Au-30的X射線衰減能力分別是同濃度碘溶液的

14、1.72、1.91和2.12倍。
　　3.利用金和巰基之間的強配位作用，成功將t-BBN連接在Fe3O4@Au納米粒表面制備出胃泌素釋放肽受體靶向MRI/CT雙模態(tài)探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。CCK-8檢測結(jié)果顯示Fe3O4@Au-PEG-BBN探針具有較好的生物相容性，未顯著降低細胞的活性。普魯士藍染色結(jié)果表明探針能特異性標記人乳腺癌細胞T47-D，其標記效率顯著高于MDA-MB-231細胞組，且探針Fe3O4@Au-

15、PEG-BBN對T47-D的特異性標記作用能被游離的t-BBN多肽阻斷。透射電鏡結(jié)果也證明了探針Fe3O4@Au-PEG-BBN對T47-D細胞的特異性標記，同時提示納米探針在細胞內(nèi)主要分布于細胞核周圍的溶酶體中。
　　4.體外用系列濃度的Fe3O4@Au-PEG-BBN探針對T47-D細胞進行標記，并對標記細胞進行MRI和CT成像，結(jié)果顯示隨著濃度的升高，標記細胞的T2信號強度逐漸降低。同時，不同標記組細胞的CT值逐漸升高。采用

16、皮下種植的方法構(gòu)建人乳腺癌動物模型，并將探針Fe3O4@Au-PEG-BBN通過尾靜脈引入到動物模型體內(nèi)進行靶向MRI和CT成像。掃描結(jié)果顯示，腫瘤區(qū)域的MRI信號強度出現(xiàn)明顯的降低，且能持續(xù)較長時間，隨著時間的推移，腫瘤的信號強度逐漸回升。興趣區(qū)內(nèi)的CT值同時出現(xiàn)明顯的上升，其變化規(guī)律和MRI類似。
　　結(jié)論:
　　本研究通過不同的方法成功合成了3種磁性納米粒，篩選出一種同時具有超順磁性和高r2的磁性納米粒作為復合納米粒的

17、磁性內(nèi)核。通過種子生長的方法在磁性納米粒表面生長金殼層，并通過調(diào)整加入生長溶液的量精確控制了金殼的厚度，制備出一種同時具有優(yōu)秀r2和X射線衰減效能的MRI/CT雙模態(tài)復合納米粒Fe3O4@Au?；诮鸷蛶€基之間的強配位作用，成功將t-BBN多肽偶聯(lián)在Fe3O4@Au納米粒表面，構(gòu)建了人乳腺癌T47-D靶向分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。通過體外和體內(nèi)實驗證明Fe3O4@Au-PEG-BBN能特異性靶向T47-D細胞，實現(xiàn)人乳腺