CD105靶向金磁納米粒的合成及其對乳腺癌血管生成的MRI和CT實驗研究.pdf

1、目的:
　　1.合成不同Au殼層厚度的金磁納米粒Fe2O3@Au,研究Au殼層厚度對納米粒磁化率和X射線吸收能力的影響,制備一種適用于磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)和X射線計算機斷層攝影(computed tomography, CT)的雙模態(tài)對比劑;
　　2.制備CD105靶向的分子探針Fe2O3@Au-PEG-CD105,探討將它應(yīng)用于MRI和CT成像評價乳腺癌血管生成的可行

2、性。
　　材料與方法:
　　1.Fe2O3@Au納米粒的合成及表征:在氮氣保護下,以氯化鐵和氯化亞鐵為反應(yīng)底物,采用化學(xué)共沉淀法合成Fe3O4納米粒,在酸性條件下,將Fe3O4氧化生成Fe2O3。以Fe2O3為種子顆粒、氯金酸為還原底物、鹽酸羥氨為還原劑,通過迭代還原法,將Au3+還原于Fe2O3表面,還原反應(yīng)分5次進行,合成不同Au殼層厚度的Fe2O3@Au納米粒。對合成的Fe2O3@Au納米粒進行表征,包括電感耦合等離子

3、體發(fā)射光譜儀定量各納米粒的元素組成、透射電子顯微鏡檢測納米粒的形態(tài)和粒徑、紫外-可見光分光光度計全波長掃描測量各納米粒在400~800 nm區(qū)間的吸收曲線、Zeta激光粒度儀測量各納米粒的水力學(xué)直徑和Zeta電位、振動樣品磁強計檢測各納米粒的飽和磁化強度、MRI掃描檢測系列濃度納米粒溶液的磁化率、CT掃描測量系列濃度納米粒溶液的X射線吸收能力。
　　2.Fe2O3@Au納米粒的表面修飾及穩(wěn)定性分析:選擇巰基聚乙二醇、巰基-聚乙二醇

4、-羧基、巰基丙酸、谷胱甘肽,分別對Au還原次數(shù)為3的Fe2O3@Au納米粒進行表面修飾,以分光光度計和Zeta激光粒度儀為檢測手段,對比四種巰基化合物修飾的Fe2O3@Au納米粒在pH值為5.0~9.0和鹽濃度為0.01~0.10 M溶液中的穩(wěn)定性。
　　3.Fe2O3@Au-PEG-CD105的合成及其細胞標記作用:利用修飾物HS-PEG-COOH提供的-COOH末端,將Fe2O3@Au納米粒與抗CD105抗體的-NH2末端反應(yīng)

5、形成酰胺鍵,合成CD105靶向的分子探針Fe2O3@Au-PEG-CD105。以人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為細胞模型,采用噻唑藍法(MTT法)研究Fe2O3@Au-PEG-CD105的細胞毒性,普魯士藍鐵染色和免疫標記技術(shù)研究該探針對HUVECs細胞的特異性標記作用,透射電鏡觀察它在HUVECs細胞內(nèi)的代謝情況。
　　4.Fe2O3@Au-P

6、EG-CD105用于乳腺癌血管生成的MRI和CT靶向成像:將Fe2O3@Au-PEG-CD105與HUVECs細胞共培養(yǎng),MRI和CT成像評價它的靶向標記作用和成像效果。將人乳腺癌MBA-MD-231細胞移植于裸鼠背部,建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,從裸鼠尾靜脈引入Fe2O3@Au-PEG-CD105后,于不同時間點MRI和CT成像觀察該探針的靶向標記和體內(nèi)分布情況。掃描結(jié)束后,切除腫瘤行CD105免疫組織化學(xué)染色和普魯士藍鐵染色,檢測腫瘤

7、MVD,分析感興趣區(qū)信號強度與腫瘤MVD的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.通過共沉淀法和迭代還原法制備了不同Au還原次數(shù)的Fe2O3@Au納米粒,各納米粒的平均粒徑為36.5~56.5 nm,全波長掃描下的吸收峰位于500~600 nm區(qū)間,飽和磁化強度為42.4~59.6 emu/g,在水溶液中均表現(xiàn)為正電位,多分散系數(shù)均大于0.1。對還原次數(shù)分別為1、3、5的Fe2O3@Au納米粒的弛豫效能比較后發(fā)現(xiàn),隨著Au殼層厚度的增

8、加,納米粒的T2*弛豫效能由115 mM-1S-1下降為61 mM-1S-1;3種納米粒金殼層的X射線吸收能力分別為碘的1.65、1.84和2.04倍。其中,Au還原次數(shù)為3的Fe2O3@Au納米粒粒徑為48.3 nm,金殼層平均厚度為18.3 nm,Fe2O3和Au的摩爾比為7.2︰26.8,該復(fù)合納米粒呈超順磁性,飽和磁化強度為49.0 emu/g,T2*弛豫效能為95 mM-1S-1,金殼層的X射線吸收能力是碘的1.84倍。結(jié)果顯

9、示Au還原次數(shù)為3的Fe2O3@Au納米粒的各項指標較為均衡,既滿足MRI增強成像所需的超順磁性,也具備較強的X射線吸收能力,符合MRI和CT成像的基本需求。
　　2.對Au還原次數(shù)為3的Fe2O3@Au納米粒進行巰基聚乙二醇、巰基-聚乙二醇-羧基、巰基丙酸、谷胱甘肽表面修飾后,其Zeta電位從14.5 mV分別下降為2.1 mV、-19.3 mV、-16.7 mV、-22.8 mV;水力學(xué)直徑從55.2 nm分別增大為84.9

10、nm、85.2 nm、65.9 nm、70.3 nm。在pH值為5.0~9.0以及鹽濃度為0.01~0.10 M溶液中,與巰基丙酸和谷胱甘肽相比,巰基聚乙二醇和巰基-聚乙二醇-羧基修飾的 Fe2O3@Au納米粒均保持較高的分散性和穩(wěn)定性。
　　3.利用巰基-聚乙二醇-羧基提供的-COOH末端,將納米粒與抗CD105抗體通過酰胺化作用相結(jié)合,成功制備了 CD105靶向的分子探針 Fe2O3@Au-PEG-CD105。將人乳腺癌MDA

11、-MB-231細胞與HUVECs細胞共培養(yǎng),誘導(dǎo)HUVECs細胞向腫瘤性血管內(nèi)皮細胞分化,流式細胞技術(shù)檢測HUVECs細胞上CD105的表達率為86.84％。普魯士藍鐵染色、免疫熒光標記和免疫細胞化學(xué)染色證明 Fe2O3@Au-PEG-CD105對HUVECs細胞的標記是特異性的,并能被抗CD105抗體所阻斷。透射電鏡研究結(jié)果提示Fe2O3@Au-PEG-CD105可能通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進入HUVECs細胞。
　　4.將Fe2

12、O3@Au-PEG-CD105標記的HUVECs細胞用于MRI和CT成像,隨著該探針濃度從0.1 mM升高至1.0 mM,各組細胞溶液的MRI信號強度逐漸降低,標記細胞的 CT值有一定程度的增高,但在 CT圖像上表現(xiàn)不明顯。采用裸鼠皮下注射人乳腺癌 MDA-MB-231細胞的方式成功建立乳腺癌移植瘤模型。對移植瘤的掃描結(jié)果顯示,Fe2O3@Au-PEG-CD105注射后,腫瘤感興趣區(qū)的MRI信號強度隨時間的延長呈“下降-上升-平臺型”表

13、現(xiàn);腫瘤感興趣區(qū)的CT值有所增強,其增強趨勢與MRI信號強度的變化趨勢相同。結(jié)合免疫組織化學(xué)和普魯士藍鐵染色結(jié)果,證明Fe2O3@Au-PEG-CD105能與腫瘤新生血管靶向結(jié)合,感興趣區(qū) MRI相對信號強度與腫瘤微血管密度正相關(guān)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　本課題合成了不同Au殼層厚度的Fe2O3@Au納米粒,對納米粒的物質(zhì)構(gòu)成比進行優(yōu)化,制備了一種可用于MRI和CT成像的雙模態(tài)對比劑。基于Fe2O3@Au納米粒合成