新型肝靶向納米多肽遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及性能評價.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一個全球公共健康難題，常規(guī)治療策略的效果不盡如人意?；蛑委煘楦伟┯绕涫沁M展期肝癌的治療帶來了一線曙光，截止目前共有17項肝細胞癌基因治療臨床試驗正在進行，有望成為肝癌的克星。
　　基因治療載體決定了治療基因表達的特異性和效率，對它的設(shè)計和構(gòu)建是基因治療的關(guān)鍵因素和研究難點?；蛑委熭d體要保護治療基因免遭核酸酶破壞，并能夠特異性識別和進入靶細胞，之后還要面臨復(fù)雜

2、的細胞內(nèi)環(huán)境，完成“逃離內(nèi)吞體”、避免“溶酶體降解”、定位到細胞核并啟動治療基因表達等一系列極具挑戰(zhàn)的任務(wù)。
　　近年來，人工設(shè)計仿生載體（Designer biomimetic vector，DBV）作為基因治療載體備受矚目。一個高效的仿生載體包括核酸濃縮基序(DNA condensingmotif，DCM)、靶向肽段（Targeted peptide，TP）、內(nèi)吞體裂解基序(Endosomedisrupting motif，E

3、DM)、核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)等基本要素。DBV通過DCM與治療基因自組裝成納米尺寸的顆粒，防止血清中核酸酶對治療基因的降解;TP的靶向作用可以經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑將基因治療載體攜帶至靶細胞內(nèi);而EDM能夠破壞內(nèi)吞體膜將基因治療載體從內(nèi)吞體釋放至胞漿中，并通過NLS的核定位作用將其定位至胞核實現(xiàn)治療基因的高效表達。
　　本人所在的課題組既往的研究證實來源于瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(C

4、ircumsporozoite protein，CSP)的CSR2a肽段是一個新的理想的肝特異性靶向配體分子，對構(gòu)建高效的肝癌基因治療靶向遞送系統(tǒng)具有較高的研究價值。另外，我們前期通過分析、鑒定獲得了一種新型腫瘤特異性啟動子-FZD7(Frizzled-7)啟動子，研究證實其具有突出的肝癌特異性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
　　目的：
　　在本研究中，以CSR2a作為特異配體設(shè)計、構(gòu)建及評價了一種新型肝靶向納米多肽遞送系統(tǒng)，為進一步實現(xiàn)

5、FZD7啟動子調(diào)控下的肝癌精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.設(shè)計并利用基因工程重組技術(shù)制備基于CSR2a小肽的肝靶向遞送DBV。用免疫印跡實驗驗證His-tag;采用紅細胞溶血和組織蛋白酶D酶切位點鑒定實驗，檢測DBV pH依賴的內(nèi)吞體胞膜裂解功能及靶向配體分子的釋放效應(yīng)。
　　2.將DBV與質(zhì)粒pEGFP-N1進行混合，對影響包裹率的緩沖液、孵育溫度及孵育時間等因素進行分析;利用瓊脂糖凝膠電泳、Zeta電位儀、

6、Nanosight納米顆粒分析儀和透射電子顯微鏡等對所形成納米顆粒的粒徑、負載電荷、pH穩(wěn)定性、中和效應(yīng)等表征進行分析。
　　3.通過血清穩(wěn)定性實驗、靶向肽段抑制試驗和細胞毒性實驗分析納米粒子DBV/pEGFP-N1的抗核酸酶降解能力、肝靶向性、細胞毒性等性能;最后，采用體外細胞實驗、動物體內(nèi)實驗驗證DBV的肝靶向遞送功能。
　　結(jié)果：
　　1.成功制得8種較高純度的DBV，其中只有DBV3的靶向肽段可被切除，被用于后

7、續(xù)實驗;pH7.4時DBV3不會使紅細胞裂解，而pH5.5時發(fā)生裂解，證實了DBV3在酸性條件下具有胞膜裂解能力。
　　2.室溫或者37℃條件下，在pH5.5的醋酸鹽緩沖液中N/P（氮磷比）為10時，孵育1h更利于納米顆粒的自組裝，包裹率達到(99.1±0.7)％，所形成的DBV3/pEGFP-N1球形納米粒子水合粒徑為132±3.1nm，負載電荷為+28.5±1.3 mV。
　　3.DBV3/pEGFP-N1納米粒子中的p

8、EGFP-N1質(zhì)粒不會被血清中的核酸酶降解;靶向肽CSR2a與細胞孵育后，可以競爭性抑制DBV3/pEGFP-N1的肝靶向性能;DBV3/pEGFP-N1對細胞沒有明顯的毒性效應(yīng)，且可以靶向進入正常肝細胞和肝癌細胞;硫酸長春新堿可以抑制DBV3/pEGFP-N1向核運輸;體內(nèi)遞送實驗中，正常肝組織中有明顯熒光，而心、腎、脾、胃等組織中并未有熒光蛋白表達。
　　結(jié)論：
　　本研究成功構(gòu)建了一種以CSR2a小肽作為特異性肝靶向配