一種新型生物型人工肝的構(gòu)建及評價.pdf

1、背景急性肝衰竭(acutehepaticfailure，AHF)病情危篤，進(jìn)展迅速，預(yù)后兇險，是臨床亟待解決的治療難題。盡管近年來內(nèi)科綜合治療措施取得了較大進(jìn)展，AHF患者病死率依然高達(dá)50～80％。肝移植可以顯著降低肝衰竭患者病死率，但由于供肝嚴(yán)重短缺，事實(shí)上僅有不足1/3的患者接受了肝移植手術(shù)，而大多數(shù)患者在等待供肝的過程中死亡?；诖朔N前提下，國內(nèi)外學(xué)者設(shè)計、構(gòu)建了不同類型的人工肝系統(tǒng)，希冀借助一種體外的機(jī)械、理化或者生物的裝置，

2、清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質(zhì)，補(bǔ)充必需物質(zhì)，改善內(nèi)環(huán)境，暫時替代衰竭肝臟的部分功能，為肝衰竭患者肝細(xì)胞再生及肝功能恢復(fù)創(chuàng)造條件，或等待供肝進(jìn)行肝移植，從而降低患者病亡率。 人工肝分為非生物型、生物型及混合型3種類型。非生物型人工肝側(cè)重于代償肝臟的解毒作用，其不能完全替代肝臟的合成、代謝功能。生物型人工肝(bioartificialliver，BAL)或者混合型人工肝(hybridartificialliver，HAL)則可以彌

3、補(bǔ)非生物型人工肝的上述缺陷，其依賴接種于生物反應(yīng)器中的活的肝細(xì)胞，從理論上講可以代償肝臟的全部功能。故而，構(gòu)建BAL及HAL已經(jīng)成為人工肝領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。近年來，不同類型的BAL和HAL不斷出現(xiàn)，迄今4種BAL或HAL系統(tǒng)業(yè)已開始進(jìn)行Ⅱ-Ⅲ期臨床驗(yàn)證，其中大多采用中空纖維管型生物反應(yīng)器，氧合的血漿流經(jīng)中空纖維內(nèi)腔以供應(yīng)肝細(xì)胞氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，譬如HepatAssist、ELAD等。初步結(jié)果證明這些BAL或HAL治療是安全、有效的，沒有明

4、顯的不良事件出現(xiàn)。但是，由于血漿攜氧能力不足全血的1/10，因此，這些系統(tǒng)的氧供遠(yuǎn)不能滿足肝細(xì)胞的需要，很大部分的肝細(xì)胞可能處于缺氧狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞活性降低和肝細(xì)胞功能不良，最終導(dǎo)致這些人工肝系統(tǒng)的療效降低。 為解決生物反應(yīng)器中肝細(xì)胞缺氧問題，我們與日本岡山大學(xué)共同研制了一種全血灌流式無紡布編織型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器由聚四氟乙烯無紡布螺旋折疊、纏繞聚砜中空纖維管而成。其中空纖維管外腔接種肝細(xì)胞，繞成螺線狀的無紡布作為附著

5、介質(zhì)供肝細(xì)胞附著，而中空纖維管內(nèi)腔供全血灌流，以保證生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞得到充分的氧氣供應(yīng)。 本研究中，我們以這種無紡布編織型生物反應(yīng)器接種新鮮分離的原代豬肝細(xì)胞，結(jié)合生物反應(yīng)箱、蠕動泵、肝素泵等構(gòu)建了一種簡單、新穎的全血灌流式BAL，并應(yīng)用豬AHF模型對其進(jìn)行療效和安全性評價。具體包括以下兩部分研究內(nèi)容： 1.無麻醉?xiàng)l件下D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的豬AHF模型的建立； 2.新型生物型人工肝的構(gòu)建及評價。 第一

6、部分無麻醉?xiàng)l件下D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的豬急性肝衰竭模型的建立 目的:穩(wěn)定的具有潛在可逆性和良好重復(fù)性的大動物AHF模型對人工肝評價研究至關(guān)重要。為改善模型的重復(fù)性，本研究擬在無麻醉?xiàng)l件下，通過靜脈注射不同劑量的D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-gal)以建立杜洛克種豬AHF模型，觀察動物的臨床、生化及組織學(xué)變化特征，摸索無麻醉?xiàng)l件下誘發(fā)豬AHF的合適的D-gal劑量，為下一步開展的新型BAL的療效和安全性評價研究

7、奠定基礎(chǔ)。 材料和方法:選取雄性杜洛克種豬作為模型動物。 結(jié)果:注射D-gal后，15只受試動物均逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、煩躁、站立不穩(wěn)、步態(tài)蹣跚等表現(xiàn)。其中接受1.0g/KgD-gal注射的3只動物于注射后64～79h(71±8h)出現(xiàn)持續(xù)性昏迷，直至死亡，1只于注射D-gal68h后出現(xiàn)一過性昏迷，隨之好轉(zhuǎn)，另外1只僅出現(xiàn)昏睡，未見昏迷；而接受1.25和1.5g/KgD-gal注射的所有動物分別于注射后39～82h(56±

8、11h)及20～43h(28±5h)出現(xiàn)持續(xù)性昏迷，直至死亡。對照組4只動物未見異常。 結(jié)論:1.在無麻醉狀態(tài)下成功建立了D-gal誘導(dǎo)的杜洛克種豬AHF模型； 2.D-gal誘導(dǎo)的杜洛克種豬AHF模型具有與人類AHF相似的臨床、生化和病理學(xué)特征。 3.D-gal誘導(dǎo)的杜洛克種豬AHF模型具有潛在可逆性和良好的重復(fù)性，動物死于AHF，且具有合適的治療時間“窗口”，適合應(yīng)用于人工肝臨床前評價研究。 第二部

9、分新型生物型人工肝的構(gòu)建及評價 目的:本研究旨在設(shè)計一種新型生物型人工肝，通過動物實(shí)驗(yàn)評價其療效和安全性，探討其臨床應(yīng)用的可行性。 材料和方法:整個新型BAL的設(shè)計包括1個蠕動泵，1個肝素泵，1個無紡布編織型生物反應(yīng)器，1只內(nèi)部溫度為37℃的恒溫生物反應(yīng)箱，以及1套聚乙烯膠管構(gòu)成的封閉循環(huán)管路等。整個系統(tǒng)總預(yù)充量約為120ml。其中無紡布編織型生物反應(yīng)器由聚四氟乙烯無紡布螺旋折疊、纏繞500根聚砜中空纖維管而成。

10、 選取雄性中國實(shí)驗(yàn)用小型豬(體重5～10Kg)作為肝細(xì)胞供體，采用本實(shí)驗(yàn)室建立Dsipase—膠原酶4步灌流法分離、獲取原代豬肝肝細(xì)胞。 選取雄性杜洛克種豬(體重20～25Kg)作為模型動物，在無麻醉?xiàng)l件下靜脈注射D-gal(1.3g/Kg)建立豬AHF模型。注射D-gal12h后，15只AHF豬隨機(jī)分成3組，即(1)BAL治療組(n=5)：動物接受BAL治療6h，生物反應(yīng)器內(nèi)接種1.0～1.3×109新鮮分離的原代豬肝細(xì)胞；(

11、2)BAL裝置對照組(n=5)：動物同樣接受BAL治療6h，但生物反應(yīng)器內(nèi)未接種豬肝細(xì)胞；以及(3)AHF對照組(n=5)：動物僅于建模后進(jìn)行監(jiān)護(hù)，未給予任何治療措施。 觀察動物臨床表現(xiàn)及BAL治療過程中出現(xiàn)的不良事件；記錄動物生存時間；動態(tài)檢測血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板、凝血酶原時間、血氨、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽紅素、膽汁酸、肌酐、尿素氮、血糖、L-乳酸、氨基酸(計算Fischer指數(shù))等；死亡動物立即尸檢，分別制作肝臟、

12、心臟、腎臟、腦、肺、脾臟、胰腺及胃腸等標(biāo)本，存活動物于注射D-gal15d后經(jīng)腹直視下切取肝組織活檢，光鏡及電鏡下觀察上述組織的病理學(xué)變化。此外，于BAL治療開始及結(jié)束時采樣，臺盼蘭拒染試驗(yàn)檢測生物反應(yīng)器中肝細(xì)胞活度。 結(jié)果:所有動物均可以很好的耐受BAL治療，治療過程中無明顯的不良事件出現(xiàn)。治療結(jié)束后，BAL治療組動物保持清醒，此后，3只動物逐漸出現(xiàn)昏睡、站立困難，并于注射D-gal53～68h(61±8h)后出現(xiàn)持續(xù)性昏迷，

13、直至死亡，另外2只僅出現(xiàn)一過性昏迷；BAL裝置對照組及AHF對照組全部動物分別于注射D-gal24～62h(40±15h)及27～59h(44±14h)后出現(xiàn)持續(xù)性昏迷。與其他兩組相比，BAL治療組動物出現(xiàn)持續(xù)性昏迷的時間明顯延遲(P＜0.05)。 BAL治療組中2只動物存活，其余3只死亡，動物存活時間為56～168h(106±23h)；BAL裝置對照組和AHF對照組動物全部死亡，動物存活時間分別為29～68h(48±7h)和2

14、5～70h(43±8h)。Kaplan-Meier生存分析提示BAL治療可以顯著延長受試動物的存活時間(P＜0.05)。 注射D-gal12h后，全部動物均出現(xiàn)凝血酶原時間明顯延長，血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、膽汁酸、L-乳酸及血氨濃度急劇升高，血糖濃度Fischer指數(shù)(支鏈氨基酸/芳香氨基酸)顯著降低。BAL治療后，治療組動物血氨(P＜0.05)、L-乳酸(P＜0.01)濃度顯著低于兩對照組，而血糖(P＜0.01)及Fis

15、cher指數(shù)(P＜0.05)顯著高于兩對照組，凝血酶原時間雖繼續(xù)延長，但明顯低于BAL裝置對照組(P＜0.05)。 此外，BAL治療前，肝細(xì)胞活度為90％～99％；治療結(jié)束時，肝細(xì)胞活度依然保持于70～79％。 結(jié)論: 1.構(gòu)建了一種新型無紡布編織型生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器采用全血灌流，可以促進(jìn)肝細(xì)胞在體外保持較高的活性和良好的功能。 2.構(gòu)建了一種新型全血灌流式生物型人工肝。該生物型人工肝可以顯著降低受