基于普魯蘭多糖的納米藥物遞送系統(tǒng)靶向抗肝癌作用研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，且有逐年上升趨勢?；熓侵委煾伟┑某Ｓ梅椒ㄖ?，然而大部分肝癌易對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性，從而嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，探索有效的肝癌治療策略意義重大。普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多糖，具有許多優(yōu)良的生物學(xué)性質(zhì)，還是肝癌細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的天然配體，可以用作肝癌靶向載體材

2、料。本研究構(gòu)建了兩種基于普魯蘭多糖的肝癌靶向納米共載體系，用于不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物或基因與化療藥物的有效共載，以期聯(lián)合多種治療方法實(shí)現(xiàn)對肝癌的高效作用。
　　研究方法：
　　第一部分：合成 pH敏感的普魯蘭多糖衍生物 URPA；將抗腫瘤藥物甲氨蝶呤（MTX）以酯鍵與URPA偶聯(lián)，形成高分子前藥MTX-URPA；采用紅外光譜（IR）與核磁共振氫譜（1H NMR）對URPA與MTX-URPA進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)表征。利用自組裝技術(shù)制

3、備 MTX-URPA前藥型納米粒；將抗血管生成藥物康普瑞?。–A4）物理包埋于 MTX-URPA納米粒；采用透射電鏡（TEM）觀察納米粒的形貌；采用動態(tài)激光散射法檢測其粒徑；采用Zeta電位測定儀考察其表面荷電性質(zhì)；采用紫外分光光度法（UV）考察納米粒的載藥能力。利用MTT法檢測載藥納米粒對肝癌HepG2細(xì)胞的毒性，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測其在細(xì)胞中的攝取量。構(gòu)建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，采用高效液相色譜法（HPLC）考察尾靜脈注射給藥后荷瘤

4、小鼠體內(nèi)MTX與CA4的血藥濃度與組織分布及其腫瘤生長情況與腫瘤組織中血管密度，綜合評價(jià)該納米共載體系的抗腫瘤活性。
　　第二部分：通過邁克爾加成反應(yīng)合成聚氨基酯 PBAE。以綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pEGFP）為模型基因，制備PBAE/pEGFP納米復(fù)合物；采用瓊脂糖凝膠電泳考察兩者的復(fù)合情況，確定最佳PBAE/pEGFP質(zhì)量比。將MTX通過酯鍵與普魯蘭多糖偶聯(lián)形成高分子前藥MTX-PL，采用IR與1H NMR技術(shù)對其進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

5、，采用UV法檢測前藥分子中MTX的含量。將MTX-PL吸附包裹于PBAE/pEGFP納米復(fù)合物的表面，形成親水多糖外殼，制備納米共載體系。采用TEM觀察納米體系的形貌；采用動態(tài)激光散射法檢測其粒徑與粒徑分布；利用Zeta電位測定儀考察其表面荷電性質(zhì)。采用激光共聚焦顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)考察納米共載體系對HepG2細(xì)胞的親和性以及pEGFP在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率；采用CCK-8試劑盒檢測納米共載體系的細(xì)胞毒性；通過小動物活體成像技術(shù)觀察納米共載體

6、系在HepG2荷瘤小鼠體內(nèi)的分布，評價(jià)其對肝癌的靶向作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分：成功合成了URPA，其中尿刊?；〈葹?.2％。URPA具有顯著的pH敏感性，響應(yīng)pH值為6.5。MTX高效偶聯(lián)于URPA多糖骨架，形成高分子前藥 MTX-URPA；MTX的含量約為17.8%。成功制備了球狀形態(tài)的MTX-URPA納米粒，平均粒徑為187.1 nm；該納米粒表現(xiàn)出對肝癌HepG2細(xì)胞的高親和性。CA4被包載于MTX-URP

7、A納米粒中，表現(xiàn)出顯著的pH敏感體外釋藥特征。體外及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示該納米共載體系能夠?qū)崿F(xiàn)兩種治療劑的有序釋放，并有效蓄積于肝癌PLC/PRF/5荷瘤小鼠的腫瘤病灶，還具有顯著增強(qiáng)的抑瘤效應(yīng)與腫瘤血管生成抑制作用，有利于對肝癌的靶向聯(lián)合治療。
　　第二部分：成功合成了PBAE與MTX-PL，并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征；MTX-PL分子中MTX的含量約為15.2%。PBAE表現(xiàn)出對pEGFP高效的復(fù)合壓縮能力；制備PBAE/pEGF

8、P納米復(fù)合物的最佳質(zhì)量比為50/1。MTX-PL成功包覆于基因納米復(fù)合物的表面，形成具有“核殼結(jié)構(gòu)”的MTX-PL/PBAE/pEGFP納米粒，從而實(shí)現(xiàn)了基因與化療藥物的有效共載。共載納米粒的平均粒徑為172.9 nm，分布較均勻，表面呈電中性。通過納米共載體系的攜載，實(shí)現(xiàn)了pEGFP在HepG2細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染以及對肝癌細(xì)胞生長的顯著抑制。尾靜脈注射給藥后24 h，MTX-PL/PBAE/pEGFP納米粒主要分布于HepG2荷瘤小鼠的

9、腫瘤組織，具有較好的肝癌靶向性。
　　結(jié)論：
　　本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了兩種基于普魯蘭多糖的肝癌靶向納米藥物或基因/藥物共載體系。一種是攜載血管生成抑制劑與化療藥物的納米共載體系，實(shí)現(xiàn)了對兩種不同作用機(jī)制藥物的肝癌靶向遞送以及高效的抗肝癌協(xié)同作用。另一種是攜載基因（模型）與化療藥物的納米共載體系，實(shí)現(xiàn)了基因與藥物的高效共載、細(xì)胞水平的協(xié)同作用以及動物體內(nèi)的肝癌靶向遞送。這兩種納米共載體系的構(gòu)建有利于對肝癌的聯(lián)合治療，為解決臨床肝