均聚多肽納米組裝體與pH響應(yīng)性納米微粒新型靶向釋藥系統(tǒng)研究.pdf

1、過去二十多年的研究清楚地表明靶向納米遞送系統(tǒng)在藥物治療方面有明顯的優(yōu)勢。已有的研究在克服一些生理屏障、實現(xiàn)不同藥物靶向遞送方面取得了一些成果,但也面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面,目前僅有個別聚合物納米釋藥系統(tǒng)獲批臨床使用,而聚合物納米釋藥系統(tǒng)制備的復(fù)雜性和不可控性是限制目前實驗室成果向臨床轉(zhuǎn)化的主要因素之一。另一方面,在通過刺激響應(yīng)性納米遞送系統(tǒng)靶向病灶微環(huán)境來達(dá)到準(zhǔn)確定位時,具有良好生物相容性的納米系統(tǒng)的構(gòu)建依然存在一定問題亟待解決。本課題擬通

2、過兩個部分的研究來解決上述問題。課題1采用簡易的方法合成了結(jié)構(gòu)簡單的多肽,通過其自組裝形成結(jié)構(gòu)、粒徑及其分布可控的納米微粒,并以此納米微粒作為藥物載體,用于口服靶向遞送抗炎藥物吲哚美辛(IND)治療關(guān)節(jié)炎研究。課題2中我們通過動力學(xué)控制的縮醛化反應(yīng)制備了一系列pH響應(yīng)性α-環(huán)糊精材料,以其構(gòu)建pH響應(yīng)性納米微粒,作為靶向腫瘤微環(huán)境的載體;并通過一系列體內(nèi)外實驗來研究該類納米載體作為紫杉醇(PTX)遞送系統(tǒng)在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。

3、　　方法
　　1.載體材料合成
　　通過1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷引發(fā)β-芐基L-天冬氨酸、γ-芐基谷氨酸和ε-(芐氧羰基)-L-賴氨酸的N-羧基酸酐單體聚合來合成多肽1、8和9。肽1在正丁胺、正己胺、正辛胺存在下的氨解來合成肽2、3和4。制備多肽5、6和7時,首先將D,L-天冬氨酸在85％H3PO4中聚合成聚(D,L-琥珀酰亞胺),再加入正丁胺、正己胺和正辛胺即可得到多肽5、6和7。
　　合成縮醛化α-環(huán)

4、糊精(Ac-aCD)時,將α-CD在對甲基苯磺酸吡啶鹽、2-甲氧基丙烯存在下進(jìn)行一步縮醛化反應(yīng),反應(yīng)不同時間點取反應(yīng)液并沉淀得不同產(chǎn)物。葡聚糖在對甲氧基吡啶鹽、2-甲氧基丙烯存在下,一步完成縮醛化反應(yīng),3h后沉淀產(chǎn)物縮醛化葡聚糖(Ac-Dex)。1,4-環(huán)己烷二甲醇在p-甲苯磺酸和2,2-二甲氧基丙烷作用下,生成聚(1,4-環(huán)己烷二甲醇)(PCADK)。
　　2.材料結(jié)構(gòu)表征
　　材料結(jié)構(gòu)用紅外光譜(FT-IR)和核磁共振光

5、譜(NMR)來確定。飛行質(zhì)譜(MALDI-ToF)表征各多肽分子結(jié)構(gòu)和測定多肽分子量。Ac-Dex和PCADK分子量用凝膠滲透色譜法(GPC)測定。
　　3.納米粒制備
　　多肽組裝體及其載藥納米微粒通過透析法制備。將多肽或多肽和藥物溶于一定極性有機溶劑中,在水中透析除去有機溶劑即可得到不同多肽納米粒。
　　Ac-aCD納米微粒通過乳液乳劑揮發(fā)法制備。首先,用二氯甲烷溶解Ac-aCD或Ac-aCD/PTX),加入含1%

6、聚乙烯醇(PVA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,用超聲探頭超聲20s,將所得乳液傾入0.3%PVA/PBS中,攪拌揮發(fā)3h后收集納米粒。采用同樣的方法來制備PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex和PTX/PCADK納米微粒。
　　4.載藥量測定
　　精密稱取IND/多肽1載藥組裝體,用3ml乙醇萃取藥物3次,合并萃取液并定容至10ml,用紫外分光光度儀在310nm處測定IND吸光度。
　　精密稱取PTX/Ac-aCD納米

7、粒,用DMSO溶解,高效液相色譜法測定PTX濃度。
　　5.納米粒形態(tài)表征及粒徑測定
　　用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行形態(tài)表征,并用粒度儀測量粒徑大小。
　　6.Ac-aCD納米粒pH敏感性評價
　　將Ac-aCD納米粒分別置于pH7.4和pH5.0的PBS中,不同時間點觀察納米粒水解并拍照,同時測定納米粒膠體溶液的光散射強度變化。
　　7.多肽納米粒穩(wěn)定性測試
　　將空白

8、多肽納米粒置于含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的pH7.4PBS中,不同時間觀察納米粒水解并用SEM和TEM觀察形態(tài)。
　　8.體外釋放
　　將IND/多肽1納米粒裝入透析袋中,放入pH7.4PBS中進(jìn)行釋放,用IND作為對照。為了模擬IND/多肽1納米粒在胃腸道中的釋放,先將IND/多肽1納米粒和IND原料藥置于pH1.2的PBS中釋放一段時間,再置于pH7.4PBS中釋放。PTX/Ac-aCD納米粒的釋放在pH7.4PBS和p

9、H5.0PBS的介質(zhì)中進(jìn)行。
　　9.納米粒細(xì)胞毒性評價
　　將不同空白納米粒加入培養(yǎng)基中對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),用噻唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞活性,并用流式細(xì)胞儀評價Ac-aCD納米粒對細(xì)胞凋亡的影響。
　　10.PTX納米粒體外抗腫瘤評價
　　將PTX/Ac-aCD、PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex、PTX/PCADK和PTX加入培養(yǎng)基中對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),用MTT法測定細(xì)胞活性,用流式細(xì)胞儀測定P

10、TX/Ac-aCD、PTX/PLGA和PTX對細(xì)胞凋亡的影響。將PTX/Ac-aCD和PTX加入細(xì)胞培養(yǎng)基中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),不同時間點觀察藥物對腫瘤細(xì)胞微管的影響。
　　11.體內(nèi)藥動學(xué)研究
　　將IND/多肽1納米粒和原料藥給雄性SD大鼠灌胃給藥,劑量為4mg/kg,不同時間點取血測定血藥濃度。
　　12.IND/多肽1納米粒藥效學(xué)研究
　　給雄性SD大鼠灌胃給予IND/多肽1納米粒、吲哚美辛原料藥、空白多肽1

11、納米粒和生理鹽水,并測定大鼠右后足趾體積。半小時后,給大鼠右后足趾注射角叉菜膠,不同時間測定其足趾體積。
　　13.空白Ac-aCD納米粒體內(nèi)急性毒性試驗
　　昆明小鼠靜脈注射不同劑量的空白Ac-aCD納米粒,觀察小鼠身體及精神狀況。15天后,處死小鼠,測試血常規(guī),稱量臟器重量、并計算臟器指數(shù),主要臟器通過病理切片進(jìn)行觀察。
　　14.PTX/Ac-aCD納米粒藥效學(xué)研究
　　將黑色素瘤腫瘤組織塊接種到裸鼠皮下,

12、七天后,尾靜脈注射給藥,高劑量為10mg/kg、中劑量為3.3mg/kg、低劑量為1mg/kg,觀察腫瘤生長情況,測定腫瘤體積。用生理鹽水和原料藥作為對照,原料藥劑量為10mg/kg。另一組實驗中,比較Ac-Dex、PCADK、PLGA載藥納米粒的抗腫瘤活性,同樣尾靜脈注射給藥,劑量為10mg/kg。
　　15.靶向性研究
　　雄性SD大鼠皮下注射角叉菜膠,待大鼠足趾發(fā)生明顯腫脹后,灌胃給予包裹量子點(CdSe)ZnS的多肽

13、1納米粒和生理鹽水,12h后用活體成像觀察大鼠足趾熒光。
　　將Cy5載入Ac-aCD納米粒中,加入培養(yǎng)基中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),不同時間點看納米粒在細(xì)胞中的分布和轉(zhuǎn)運情況。將(CdSe)ZnS量子點載入Ac-aCD納米粒中,經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤小鼠體內(nèi),12h后觀察老鼠體內(nèi)熒光分布。
　　結(jié)果
　　1.課題1結(jié)果
　　1)經(jīng)FT-IR、NMR和MALDI-ToF表征表明成功制備了不同結(jié)構(gòu)、不同分子量的多肽。
　　

14、2)多肽成球性較好,納米粒粒徑在60-200nm之間;以DMSO作為溶劑時,納米粒粒徑分布較均勻。
　　3)細(xì)胞增殖測試顯示多肽1納米粒對細(xì)胞毒性不明顯。多肽納米粒在pH7.4PBS、含有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的PBS中孵育后,沒有發(fā)生明顯的水解和酶解反應(yīng)。
　　4)IND載藥納米粒的載藥量和包封率分別為19.8%和98.8%。DSC結(jié)果表明無明顯吲哚美辛吸收峰,說明其中藥物以分子形式分散。
　　5)體外釋放及模擬胃腸

15、道釋放結(jié)果表示IND/多肽1納米粒和IND在pH1.2環(huán)境中無釋放,pH7.4時快速釋放,且IND/多肽1納米粒的釋放速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于IND原料藥。
　　6)藥動結(jié)果顯示,IND/多肽1納米粒比IND原料藥在動物體內(nèi)釋放更快,達(dá)峰更迅速,且能較長時間維持較高的血藥濃度,藥時曲線下面積(AUC)約為IND原料藥的1.7倍。
　　7)藥效結(jié)果表明,IND/多肽1納米粒比IND原料藥能更有效減輕炎癥反應(yīng),有顯著的治療效果。
　　

16、8)靶向研究結(jié)果表明,多肽1納米粒能到達(dá)病灶部位,且能在炎癥部位富集。
　　2.課題2結(jié)果
　　1)通過FT-IR、1H-NMR分析表示成功合成了Ac-aCD,且反應(yīng)迅速,反應(yīng)數(shù)分鐘已有縮醛基團(tuán)形成。
　　2)通過對Ac-aCD納米粒的粒徑測定表明乳液法制備得到的納米粒粒徑在250nm左右,電子掃描顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察顯示材料成球性良好。
　　3)PTX/Ac-aCD載藥量在10%左右,與PLGA、Ac-

17、Dex、PCADK相比,對PTX具有更高的載藥量。
　　4)Ac-aCD納米粒在pH5.0PBS中水解速率大于pH7.4,光散射強度也下降迅速。
　　5)體外釋放結(jié)果表明PTX/Ac-aCD在pH5.0PBS中釋放速率和釋放量均明顯高于pH7.4。
　　6)細(xì)胞增殖測試顯示Ac-aCD空白納米粒毒性較小。但載入PTX后,與PTX、PTX/PLGA、PTX/Ac-Dex和PTX/PCADK相比PTX/Ac-aCD在細(xì)胞中

18、毒性有所增強,對耐藥細(xì)胞尤其明顯,能實現(xiàn)多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)。細(xì)胞凋亡實驗表明,PTX/Ac-aCD納米粒能促使腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　7)體內(nèi)毒性實驗說明Ac-aCD空白納米粒急性毒性較小,在劑量達(dá)到250mg/kg時,對動物無明顯毒性,其半數(shù)致死量在500mg/kg以上。
　　8)體內(nèi)藥效表明PTX/Ac-aCD納米粒與原料藥及PTX/PLGA納米粒、PTX/Ac-Dex納米粒和PTX/PCADK納米粒相比,具有更顯著的療效,且毒

19、副作用更低。
　　9)細(xì)胞內(nèi)靶向研究表示Ac-aCD納米粒能被細(xì)胞吞噬,通過內(nèi)涵體/溶酶體途徑轉(zhuǎn)運。體內(nèi)靶向表明,納米粒能在腫瘤部位富集,達(dá)到靶向目的。
　　結(jié)論
　　1.課題1結(jié)論
　　1)通過簡便的方法用β-芐基L-天門冬氨酸、γ-芐基谷氨酸、ε-(芐氧羰基)-L-賴氨酸和D,L-天冬氨酸合成了結(jié)構(gòu)簡單的不同多肽。
　　2)用簡單的透析法制備得到納米粒,其成球性良好,粒徑分布均勻,且穩(wěn)定性較高,不發(fā)生水

20、解和酶解反應(yīng),同時納米粒對細(xì)胞毒性較小,具有良好的生物相容性。
　　3)IND/多肽1自組裝納米粒具有較高的載藥量,并能快速釋放藥物,大大加快藥物的溶出速率,提高藥物生物利用度。自組裝納米粒在體內(nèi)保留時間明顯大于原料藥,可顯著性提高藥效,能明顯降低藥物對胃腸道的刺激性,并能在靶向部位富集,故有望作為一些藥物靶向給藥的載體材料。
　　2.課題2結(jié)論
　　1)通過簡單的縮醛化反應(yīng)合成了具有pH敏感性的材料Ac-aCD,并成

21、功制備了粒徑可控且粒徑分布較均勻的納米粒,對細(xì)胞和小鼠均無明顯毒性,具有良好的生物相容性。各反應(yīng)時間點的納米粒均具有pH敏感性,在弱酸性環(huán)境中水解速率明顯大于中性環(huán)境。載藥后在pH5.0PBS中釋放速率和釋放量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pH7.4。
　　2)由于腫瘤組織和細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體具有相對較低的pH,具有pH敏感性的Ac-aCD納米粒能靶向至腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體/溶酶體中。
　　3)將PTX載入到Ac-aCD納米粒,相對于P