胞內(nèi)微環(huán)境觸發(fā)pH氧化還原雙敏感釋藥PAMAM靶向遞藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：旨在構(gòu)建集長循環(huán)、主動靶向、pH氧化還原雙敏感、溶酶體逃逸等多功能于一體的高效、智能抗腫瘤遞藥系統(tǒng)，以期實現(xiàn)抗腫瘤藥物在腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)的有效遞送及快速釋放。同時，對所制備的復(fù)合物遞藥系統(tǒng)的體內(nèi)外抗腫瘤效果及機(jī)制進(jìn)行考察與探討。
　　方法：以4代的聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM）為聚合物骨架材料，通過酰胺反應(yīng)在其表面引入組氨酸（His），并控制PAMAM和His的反應(yīng)投料比（1：8、1：16和1：32），合成三種不同His修飾

2、程度的PAMAM-His（PH）載體；采用物理包埋的方式將抗腫瘤模型藥物阿霉素（DOX）包載在 PAMAM-His的疏水空腔內(nèi)制備一系列載藥復(fù)合物，通過體外釋放、細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取實驗等篩選最佳的 His和 PAMAM投料比。然后，聚乙二醇（PEG）通過二硫鍵將連接在PAMAM的表面，合成PSSPH聚合物；為了進(jìn)一步提高PSSPH聚合物的主動靶向作用，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，采用雙功能化的HS-PEG2000-COOH偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和

3、PSSPH，合成 Tf-PSSPH聚合物；同時選用 PEG-PAMAM（PP）和PEG-PAMAM-His（PPH）兩種聚合物作為對照，并在此基礎(chǔ)上制備了 PP/DOX、PPH/DOX、PSSPH/DOX和Tf-PSSPH/DOX四種復(fù)合物。采用氫譜（1H NMR）和動態(tài)光散射（DLS）對載體的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行表征，透析袋法考察其體外藥物釋放行為；MTT法對聚合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，并計算比較各復(fù)合物IC50值；以異硫氰酸羅丹明 B（

4、RBITC）為熒光探針標(biāo)記四種聚合物，通過共聚焦顯微鏡（CLSM）考察其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況；采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀定性及定量地考察HepG2細(xì)胞對載藥系統(tǒng)的攝取情況；通過不同的細(xì)胞抑制劑考察細(xì)胞內(nèi)吞攝取途徑，同時采用 CLSM對攝取的復(fù)合物進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究；小動物活體成像技術(shù)和體內(nèi)的抗腫瘤活性實驗用于評價復(fù)合物體內(nèi)靶向性和抗腫瘤效果；最后通過HE染色和TUNEL染色法考察復(fù)合物的組織毒性及腫瘤組織凋亡情況。
　　結(jié)果：成功合成不

5、同His修飾程度的PH，實驗篩選得到最佳的His和PAMAM投料比為32：1；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成了PP、PPH、PSSPH、Tf-PSSPH四種聚合物,并包載化療藥物DOX，所制備的載藥復(fù)合物粒徑都在15~20 nm之間，具有較高的包封率，且載藥量都在10％以上。體外釋放結(jié)果顯示Tf-PSSPH具有明顯的pH氧化還原敏感性。在一定濃度范圍內(nèi)，各載體對腫瘤細(xì)胞均無明顯毒性，表明該載體具有良好的生物相容性。Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物對

6、腫瘤的抑制率明顯高于未經(jīng)Tf修飾的復(fù)合物，同樣細(xì)胞對Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物的攝取高于PSSPH/DOX。細(xì)胞攝取機(jī)制表明Tf-PSSPH/DOX復(fù)合物主要通過Tf與TfR相結(jié)合，然后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。CLSM結(jié)果表明聚合物進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在溶酶體中，并能從溶酶體快速逃逸出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，從而在高濃度谷胱甘肽（GSH）的刺激下發(fā)生二硫鍵斷裂，迅速釋放其包載的藥物。體內(nèi)實驗結(jié)果表明與PSSPH/DOX相比，Tf

7、-PSSPH/DOX能快速到達(dá)腫瘤部位，且能明顯抑制腫瘤的生長。HE染色實驗結(jié)果顯示，Tf-PSSPH/DOX相對于游離DOX組表現(xiàn)出良好的安全性，對正常組織器官無明顯損傷。TUNEL染色實驗進(jìn)一步驗證Tf-PSSPH/DOX組腫瘤凋亡情況較為明顯。
　　結(jié)論：構(gòu)建了Tf-PSSPH/DOX多功能靶向給藥系統(tǒng)。所制備的復(fù)合物具有較高的載藥量和包封率，且體外釋放呈現(xiàn)良好的pH-氧化還原雙敏感。體內(nèi)外實驗表明Tf-PSPSH/DOX能