還原-pH雙重響應(yīng)與RGD修飾PAMAM靶向載藥系統(tǒng)及其抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、本研究旨在構(gòu)建具長循環(huán)、主動靶向、還原和 pH敏感釋藥等功能于一體的聚合物釋藥系統(tǒng)。首先以4代的聚酰胺-胺樹狀大分子（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）為聚合物骨架材料，通過二硫鍵將聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）連接在PAMAM的表面，合成不同PEG化程度的PAMAM-SS-PEG（PSSP）聚合物，然后以阿霉素（Doxorubicin，DOX）為抗腫瘤模型藥物制備了PAMAM-S

2、S-PEG/DOX（PSSP/DOX）復(fù)合物。通過考察不同聚合物對載藥系統(tǒng)體內(nèi)外活性的影響，優(yōu)選出PEG化程度最佳的聚合物PSSP32作進一步研究。為了進一步提高PSSP32聚合物的主動靶向作用，增強其抗腫瘤活性，采用雙功能化的HS-PEG5000-COOH偶聯(lián)cRGDyK多肽和 PAMAM,合成 RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM（RGD-PSSP）聚合物，并在此基礎(chǔ)上制備了RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM/DOX（RG

3、D-PSSP/DOX）復(fù)合物。隨后對復(fù)合物的制劑學(xué)特性、細胞毒性、細胞攝取、攝取機制以及荷瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤活性進行了研究。
　　首先，以4代PAMAM、SPDP和CH3O-PEG5000-HS為起始材料合成了三種不同PEG化程度的PSSP聚合物，分別稱為PSSP8、PSSP16和PSSP32。通過TLC、1H NMR和FTIR對聚合物進行了結(jié)構(gòu)確證，同時測定了三種聚合物的粒徑和Zeta電位值，并在體外考察了聚合物的還原敏感性、溶

4、血毒性及在血清中的穩(wěn)定性。此外，采用熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)考察RAW264.7巨噬細胞對聚合物的攝取情況，結(jié)果表明經(jīng)過PEG化修飾后的PSSP聚合物能顯著減少被RAW264.7細胞的攝取，有助于延長在血液中的滯留時間，實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向作用。最后，以異硫氰酸鹽羅丹明B（RBITC）為熒光探針，通過共聚焦顯微鏡（CLSM）考察了PSSP聚合物在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運情況，結(jié)果表明聚合物進入細胞后主要分布在細胞質(zhì)和溶酶體中，并能從溶酶體中逃逸出來進入細

5、胞質(zhì)中，從而在高濃度谷胱甘肽（GSH）的刺激下發(fā)生二硫鍵斷裂，迅速釋放其包載的藥物。
　　其次，以DOX作為抗腫瘤模型藥物，通過疏水作用制備了三種不同PEG化程度的PSSP/DOX復(fù)合物，并對其制劑學(xué)性質(zhì)進行了評價。結(jié)果表明復(fù)合物具有較高的包封率，載藥量在10％左右，載藥前后其粒徑和Zeta電位均未發(fā)生明顯變化。體外釋放結(jié)果表明，PSSP/DOX復(fù)合物具有明顯的還原和pH敏感性，并且DOX的釋放程度隨著PEG化程度的增加而增加。<

6、br>　　再次，以B16和A549細胞作為腫瘤細胞模型，分別對PSSP/DOX復(fù)合物的細胞毒性，細胞攝取及胞內(nèi)的藥物分布情況進行了考察。結(jié)果表明復(fù)合物的細胞毒性隨著PEG化程度增加而增加，但細胞攝取卻隨著PEG化程度增加而減少，結(jié)合體外釋放、細胞毒性實驗及胞內(nèi)藥物分布情況，證實了細胞內(nèi)的藥物釋放是決定細胞毒性的關(guān)鍵因素。通過多種內(nèi)吞抑制劑來考察PSSP/DOX復(fù)合物的攝取機理，結(jié)果表明復(fù)合物是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)

7、吞途徑進入細胞。此外，通過酸性抑制劑氯喹和 GSH抑制劑馬來酸二乙酯（DEM）來進一步考察PSSP/DOX復(fù)合物的細胞毒作用，結(jié)果表明兩種抑制劑分別能抑制細胞內(nèi)的酸性環(huán)境和還原環(huán)境，從而導(dǎo)致復(fù)合物的細胞毒作用減弱。這也進一步證實了復(fù)合物是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入細胞，從而在細胞內(nèi)兩種不同的環(huán)境中釋放藥物。以B16荷瘤小鼠為腫瘤動物模型，考察了PSSP/DOX復(fù)合物在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，結(jié)果表明該復(fù)合物能明

8、顯抑制腫瘤的生長，并且能顯著降低DOX對小鼠的毒副作用。
　　最后，采用雙功能化的HS-PEG5000-COOH在PSSP聚合物上偶聯(lián)cRGDyK多肽合成RGD-PSSP聚合物，在此基礎(chǔ)上制備RGD-PSSP/DOX復(fù)合物并對其體內(nèi)外活性進行評價。體外釋放結(jié)果表明，RGD-PSSP/DOX復(fù)合物的釋放行為具有明顯的還原和pH敏感性，與PSSP/DOX相比，連接上RGD后對釋放無明顯影響。以人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC作為腫瘤新生血管

9、內(nèi)皮細胞模型，同時以B16細胞作為腫瘤細胞模型，對 RGD-PSSP/DOX復(fù)合物的細胞毒性、細胞攝取及攝取機理進行考察。細胞毒性結(jié)果顯示連接上RGD后顯著增加了RGD-PSSP/DOX復(fù)合物對兩種細胞的細胞毒性。細胞攝取及攝取機理研究表明，RGD-PSSP/DOX主要通過RGD多肽與細胞表面高表達的整合素αvβ3受體特異性的相互識別來與細胞接觸，然后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和細胞膜穴樣內(nèi)陷介導(dǎo)的內(nèi)吞兩種方式被細胞攝取。B16荷瘤小鼠的體