智能靶向納米凝膠的構(gòu)建及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一，而傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化療、放療三大治療方法由于缺乏靶向性，在治療腫瘤的同時(shí)對(duì)機(jī)體的正常器官組織產(chǎn)生嚴(yán)重的的毒副作用，并且，晚期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后多不良，其療效難以進(jìn)一步提高。在腫瘤的靶向治療領(lǐng)域，基因治療研究正日益受到科學(xué)家的普遍關(guān)注和重視。腫瘤基因治療(tumor gene therapy)是腫瘤治療研究中的一項(xiàng)突破，它是伴隨著基因操作和DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來(lái)的治療手段，首先將外源性基因

2、（基因片段、pDNA、RNA等）導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過(guò)修正、補(bǔ)償、替代或者抑制腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的，也是目前腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤的基因治療面臨的首要技術(shù)問(wèn)題是選擇一個(gè)靶向、安全、高效的載體，能夠?qū)?qiáng)負(fù)電性的基因?qū)氲桨屑?xì)胞。傳統(tǒng)的物理導(dǎo)入技術(shù)有顯微注射法、電穿孔法等，雖然轉(zhuǎn)染效率比較高，但是對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求很高，而且只能在皮膚、肌肉等有限的組織中應(yīng)用，對(duì)靶細(xì)胞也有一定的損害，無(wú)法在體內(nèi)進(jìn)行。病毒

3、載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體及腺病毒相關(guān)的病毒載體等）雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但是存在明顯的非靶向性、高免疫原性等缺陷，而且病毒載體的安全性問(wèn)題一直備受爭(zhēng)議。雖然以陽(yáng)離子脂質(zhì)體(liposome)為代表的非病毒載體克服了病毒載體安全性等問(wèn)題，但是其血清穩(wěn)定性差、載體體系組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)尺寸分布寬，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染效率偏低，雖然透過(guò)添加各種輔助成分（膽固醇、乳化劑和分散劑等）可以提高轉(zhuǎn)染效率，但是大量的輔劑的引進(jìn)降低了其臨床應(yīng)用價(jià)值。所以，設(shè)計(jì)制備

4、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體內(nèi)外穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染效率高、特異靶向性的新型非病毒納米載體是基因治療的關(guān)鍵。
　　 在本研究中，我們用溫度敏感性的親水化合物——N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)修飾陽(yáng)離子高分子——聚乙烯亞胺(PEI，25KD)，二者形成兩親性的共聚物。該共聚物能夠隨著體積相變溫度(VPTT)約32℃，進(jìn)行自組裝，形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的溫敏性的PNIPAM/PEI納米凝膠。隨后，我們通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)證實(shí)該納米凝膠為粒徑較窄（約30

5、0nm）、結(jié)構(gòu)明確的的核-殼結(jié)構(gòu)。該納米凝膠復(fù)合體明顯比PEI表面電位低，下降到約20mV，而在293T細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)證明該納米凝膠的材料毒性較PEI明顯降低。由于PNIPAM/PEI納米凝膠復(fù)合體的大小均一（約300nm）、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以及較弱的表面電位（約2mV），其在含有血清的條件下，轉(zhuǎn)染效率提高了約2倍。當(dāng)溫度接近腫瘤病灶部位溫度時(shí)，溫度T大于VPTT時(shí)，轉(zhuǎn)染效率提高了2倍。我們用小動(dòng)物活體成像儀(Caliper Life Scie

6、nces，Hokpinton，MA)來(lái)檢測(cè)我們制備出的這種穩(wěn)定、均一的納米凝膠復(fù)合體通過(guò)尾靜脈注射方式在荷瘤裸鼠體內(nèi)24小時(shí)的富集情況。最后用我們制備出的溫敏的、在血清中具有較高穩(wěn)定性的PNIPAM/PEI納米凝膠復(fù)合體包裹、轉(zhuǎn)染蓖麻毒素A(RA)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pRA-EGFP。我們發(fā)現(xiàn)，制備的納米凝膠復(fù)合體可以將pRA-EGFP質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞，并且由于納米凝膠復(fù)合體具有在血清中高穩(wěn)定性，細(xì)胞靶向性以及增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子緩沖能力等特性

7、，經(jīng)該納米凝膠復(fù)合體包裹pRA-EGFP質(zhì)粒處理后的荷瘤裸鼠乳腺腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，其中通過(guò)尾靜脈注射方式給藥的腫瘤體積相對(duì)于對(duì)照減少了2.3倍，而通過(guò)瘤內(nèi)給藥組的腫瘤體積相對(duì)于對(duì)照組減少了5倍。我們的研究結(jié)果表明我們制備出的低毒、溫敏性的具有核-殼結(jié)構(gòu)的PNIPAM/PEI陽(yáng)離子納米凝膠復(fù)合體能夠成為高效的基因治療載體。
　　 本論文針對(duì)腫瘤臨床治療的問(wèn)題，圍繞腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)，通過(guò)高分子設(shè)計(jì)及智能納米載體的制備，體內(nèi)外的系