殼聚糖智能靶向抗腫瘤藥物運載系統(tǒng)研究.pdf

1、由于非特異毒性、缺乏腫瘤選擇性以及腫瘤的多藥耐藥性等，大多數(shù)抗腫瘤藥物并不像預(yù)期那樣有效，其對正常組織的毒副作用更是困擾化療的主要問題。因此，尋求對腫瘤細胞有特異選擇性的高效抗癌制劑具有重要的現(xiàn)實意義
　　納米藥物運載系統(tǒng)因具有一定的組織靶向性，在腫瘤靶向治療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。為提高載體靶向能力，除了控制載體粒徑在納米級通過高通透和滯留（enhancedpermeabilityandretention，EPR）效應(yīng)實現(xiàn)被動靶

2、向外，還可通過物理化學(xué)靶向?qū)崿F(xiàn)納米藥物的腫瘤靶向治療。由于腫瘤組織細胞外pH值明顯低于正常組織，相差約0.5-0.7pH，可作為癌癥治療的標志物。因此，pH敏感的聚合物膠束和納米凝膠被用作靶向?qū)嶓w腫瘤細胞外酸性環(huán)境的智能響應(yīng)型藥物釋放體系的研究成為近年來腫瘤治療的研究熱點。
　　同時，可在微粒表面連接特定抗體或配體實現(xiàn)主動靶向。由于抗原-抗體、受體-配體之間高特異性、高選擇性和高親和性的特點，主動靶向較被動靶向具有更高的靶向效率，

3、因而主動靶向釋藥系統(tǒng)的研究在國內(nèi)外也都非常活躍。
　　但迄今為止，有關(guān)抗癌藥物靶向給藥系統(tǒng)的研究，大多以靶向至腫瘤組織為目的，如何使更多的藥物到達腫瘤部位后進入腫瘤細胞，真正達到腫瘤細胞靶向給藥的目的，是近幾年靶向給藥系統(tǒng)的研究重點。盡管很多藥物運載系統(tǒng)表現(xiàn)出了相當(dāng)好的腫瘤靶向性，可以將藥物遞送至腫瘤細胞表面，但由于載體與靶細胞結(jié)合后入胞能力較弱，相當(dāng)大一部分的藥物在細胞外釋放，藥物作用同時也激活腫瘤細胞膜多種基因，多種分子機制協(xié)

4、同參與耐藥表型的形成，構(gòu)成耐藥性，進一步降低了藥物入胞效率，使胞內(nèi)藥物濃度過低，無法有效抑制腫瘤細胞的生長，由此可見，如何克服主動靶向給藥體系的缺陷，彌補隨之帶來的多藥耐藥性問題是藥物轉(zhuǎn)運中的一個關(guān)鍵問題。
　　為實現(xiàn)pH響應(yīng)性釋藥、靶向給藥、高效入胞相結(jié)合的策略，本課題首先篩選智能響應(yīng)藥物載體，研究制備P(CS/NIPAAm)納米粒，分別包裹三種不同抗腫瘤藥物，選取兩種不同腫瘤細胞模型，對其理化性能，釋藥特性，及腫瘤響應(yīng)性藥物釋

5、放進行研究。再用FA修飾CS，制備能靈敏響應(yīng)腫瘤pH值釋藥的聚合物膠束系統(tǒng)，并同時裝載抗腫瘤藥物DOX和增敏劑PDTC，研究其理化性能，pH響應(yīng)釋藥特性，主動靶向特性及PDTC增敏DOX抗腫瘤藥物的程度。為進一步提高載體的載藥率，擬用負電荷金納米粒C5-Au-C11-COOH載藥，本階段主要研究CS和FA-CS轉(zhuǎn)運體系對負電荷金納米粒的轉(zhuǎn)運能力。
　　實驗一在酸敏性聚合物CS的表面修飾以溫敏性材料NIPAAm，通過調(diào)節(jié)配比，使制備

6、的納米藥物載體具有響應(yīng)腫瘤組織pH值的能力。兩親性聚合物CS-g-NIPAAm自身形成核殼納米粒，疏水的PNIPAAm為核，親水的CS為殼。在此項研究中，CAMP、POD和PTX通過物理吸附法被成功包裹入P(CS/NIPAAm)納米粒的核中。載藥率分別為8.4％，2.54％，9.6％；包裹率為73.7％，63.7％，85.7％?？瞻准{米粒及載藥納米粒形態(tài)圓整，粒度均勻，粒徑在50-100nm之間。納米粒密封貯存于4℃冰箱或室溫三個月后，

7、納米粒流動性良好，藥物無泄漏，穩(wěn)定性良好。P(CS/NIPAAm)載藥納米粒在不同pH值時的藥物釋放呈pH敏感性。溶液pH值小于6.9時，藥物累計釋放率激增，而當(dāng)溶液pH值從pH6.9升高至pH7.5時，藥物累計釋放率下降，呈現(xiàn)出明顯的pH依賴釋放特性。在溫度敏感方面，PNIPAAm載藥納米粒和P(CS/NIPAAm)載藥納米粒的溫敏釋藥點相似，并無明顯差別。由于該聚合反應(yīng)溫度高于PNIPAAm的LCST，PNIPAAm在反應(yīng)過程中變得

8、疏水。隨著溫度的升高，PNIPAAm的疏水性呈增強趨勢。而藥物累計釋放率隨溫度升高而增大，就是由于PNIPAAm更加疏水，核收縮，促進藥物釋放。模擬生理正常組織微環(huán)境與腫瘤組織微環(huán)境，進行藥物累計釋放對比。研究結(jié)果表明，在正常組織生理條件下，藥物累計釋放率均為30-40％，而在腫瘤組織微環(huán)境時，累計釋放率激增至約90％。腫瘤組織低pH值促進CS外殼的溶脹，而腫瘤組織的相對高溫促進了PNIPAAm的內(nèi)核收縮，兩者結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)含藥物累計釋放率

9、激增。為更細致的觀察納米粒與細胞的作用，本課題采用熒光素標記納米粒，使其與腫瘤細胞共培養(yǎng)，用熒光顯微鏡與熒光強度檢測儀分別檢測細胞內(nèi)熒光強度，研究不同pH值培養(yǎng)液中細胞內(nèi)熒光強度變化，從而研究納米粒細胞內(nèi)攝作用。結(jié)果表明，pH7.4時，細胞呈現(xiàn)微弱熒光，而在pH6.8時，細胞熒光強度明顯增強。上述結(jié)果表明，P(CS/NIPAAm)載藥納米粒能靈敏響應(yīng)腫瘤組織細胞外pH值，進行藥物釋放，具備了作為靶向抗腫瘤藥物載體的潛質(zhì)。
　　實驗

10、二的反應(yīng)主要通過CS主鏈上的游離氨基與FA上的羧基形成酰胺鍵，達到CS化學(xué)修飾的目的。1H-NMR和13C-NMR譜圖證明了FA成功接合至CS骨架上。FA-CS的取代度為13.79％。利用芘熒光探針在分子水平上對FA-CS溶液的構(gòu)象行為進行了研究，結(jié)果表明環(huán)境pH小于7時，發(fā)生質(zhì)子化作用，顯示親水性，在pH5時，CAC約為58μg/mL;pH大于7時，發(fā)生去質(zhì)子化作用，顯示疏水性，CAC約為2μg/mL。pH8時，聚合物形成穩(wěn)定的膠束。

11、隨著pH降低,臨界膠束濃度(CMC)明顯降低，膠束溶液透光率和透射率逐漸增大,穩(wěn)定性減弱，聚合物發(fā)生離子化，親水性增加，膠束開始解離。測定膠束粒徑，表明pH對粒徑分布具有影響：pH<7時，納米粒溶脹加速，大粒徑粒子明顯增多，粒徑為120nm左右。當(dāng)pH繼續(xù)降低時，導(dǎo)致聚合物膠束物理穩(wěn)定性下降，膠束趨于解離，為藥物釋放提供了條件。本實驗采取了調(diào)整透析溫度、膜孔徑、聚合物、藥物比例和有機溶劑選擇等因素以提高載藥率和包裹率。DOX和PDTC的

12、包裹率分別為77.64和86.54wt％，載藥率分別為12.34和15.32wt％。本課題研究了37℃時不同pH值（pH5.0-8.0）載藥納米膠束藥物釋放行為。結(jié)果表明，DOX和PDTC的藥物釋放均呈現(xiàn)pH依賴特性。在中性或堿性pH值時，藥物釋放緩慢，而在弱酸性pH值時藥物釋放量2h內(nèi)達到75-95％。為進一步研究DOX的釋放行為及主動靶向機制，本課題采取體外熒光成像實驗進行研究。隨著DOX的釋放，入胞，從內(nèi)涵體和溶酶體中逃逸，作用于

13、其他細胞器和細胞核，藍色熒光標記的細胞核逐漸變?yōu)樽仙?。同時包裹PDTC和DOX的納米膠束給藥后，細胞內(nèi)DOX藥物熒光強度明顯增高。流式細胞儀檢測細胞內(nèi)藥物含量，結(jié)果表明單純DOX給藥細胞內(nèi)藥物濃度明顯小于FA-CS包裹DOX給藥，是FA主動靶向作用及CS能靈敏響應(yīng)腫瘤細胞外pH值藥物釋放所導(dǎo)致，而同時包裹PDTC和DOX的納米膠束，能進一步的提高細胞內(nèi)藥物濃度，表明除主動靶向和pH響應(yīng)性釋藥外，PDTC能增敏DOX，克服DOX的多藥耐藥

14、性。
　　為了進一步提高載藥量，實驗三研究了用CS和FA-CS納米凝膠包裹負電荷金納米粒的理化性質(zhì)及體外生物學(xué)特性。納米粒用1H-NMR表征結(jié)構(gòu)，動態(tài)光散射和透射電鏡研究其粒徑分布及納米粒表面形態(tài)，結(jié)果表明，負電荷金納米粒能良好包裹與CS或FA-CS納米粒中，粒徑均勻，為100nm左右離子。用westernblot篩選FR-α陽性表達細胞株，并以其為陽性對照，A549細胞為陰性對照研究FA的主動靶向作用。給藥后，用ICP-MS檢測