甘草酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒提高抗腫瘤藥物對(duì)肝細(xì)胞癌的靶向性和療效.pdf

1、肝癌、肝炎等肝臟疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，常規(guī)劑型的藥物經(jīng)靜脈注射、口服或局部注射后，藥物非特異性分布于全身，毒副作用較大。靶向給藥系統(tǒng)通過(guò)載體可將藥物選擇性遞送至肝臟的病變部位，可降低對(duì)正常組織和全身的毒副作用，減少給藥劑量和給藥次數(shù)，提高藥物功效。其中兩親性聚合物納米粒作為給藥載體，可提高難溶性藥物的溶解性和穩(wěn)定性、延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間、改善藥物體內(nèi)分布，并具有良好的緩控釋效果。聚合物納米粒表面經(jīng)特異性配體(GL)修飾，可

2、實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向。
　　據(jù)此，設(shè)計(jì)并研究新型肝靶向性聚合物納米粒-甘草酸(GL)修飾羧甲基殼聚糖納米粒(CMCNP-GL)，以紫杉醇(PTX)為抗腫瘤模型藥物制各載藥納米粒，研究PTX/CMCNP-GL的理化性質(zhì)、載藥與釋藥、體外細(xì)胞攝取與體內(nèi)組織分布、體外細(xì)胞增殖抑制與體內(nèi)抑瘤率，考察不同GL取代度對(duì)PTX/CMCNP-GL體內(nèi)外肝癌細(xì)胞靶向性及抗腫瘤效果的影響，并通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)CMCNP-GL載體的安全性。

3、
　　1、CMCNP-GL的制備與表征
　　以O(shè)-羧甲基殼聚糖(O-CMC)為親水主鏈，甲基丙烯酸甲酯(MMA)為疏水單體，在APS引發(fā)劑作用下，通過(guò)自由基聚合法制得具有核殼結(jié)構(gòu)的羧甲基殼聚糖納米粒(CMCNP)。高碘酸鈉氧化甘草酸制備GL醛，經(jīng)氨醛縮合與硼氫化鈉還原反應(yīng)將GL醛接枝至CMCNP表面游離氨基，制得CMCNP-GL。改變投料比合成不同GL取代度的CMCNP-GL1、CMCNP-GL2和CMCNP-GL4。FTI

4、R、1H NMR、DSC表征CMCNP-GL的結(jié)構(gòu)，TEM觀察納米粒形態(tài)，分別測(cè)定GL取代度、接觸角、粒徑和Zeta電勢(shì)，并研究CMCNP-GL在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明CMCNP-GL、CMCNP-GL2和CMCNP-GL4中的GL取代度分別為2.4％、6.9％和9.6％; CMCNP-GL為大小均一的球形粒子，平均水合動(dòng)力學(xué)粒徑為100～250 nm，生理?xiàng)l件下荷恒定負(fù)電(～-30 mV)。隨GL取代度的增大，粒徑先增加后減小，

5、Zeta電勢(shì)無(wú)明顯改變，納米粒表面親水性逐漸增強(qiáng)。CMCNP-GL具有良好的凍干和貯存穩(wěn)定性，不同的pH、離子強(qiáng)度及生理?xiàng)l件下理化性質(zhì)均保持穩(wěn)定。
　　2、載紫杉醇CMCNP-GL的制備、表征及體外釋藥特性
　　以PTX為模型藥物，研究CMCNP-GL作為難溶性抗腫瘤藥物載體的特點(diǎn)。超聲法制備不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL，測(cè)定其平均水合動(dòng)力學(xué)粒徑為110～205 nm，生理?xiàng)l件下Zeta電勢(shì)約為-30 mV,與相

6、對(duì)應(yīng)的空白納米粒粒徑與Zeta電勢(shì)基本相同。不同GL取代度的CMCNP-GL載藥量與包封率均隨GL取代度的增加而增大，對(duì)PTX的包封率均高于69.0％，最高可達(dá)81.5％;載藥量均高于13.0％，最高可達(dá)15.1％。PTX/CMCNP-GL的體外釋放表現(xiàn)為先突釋后緩釋的釋放行為，PTX釋放速率隨GL取代度的增加而減慢，均顯著低于PTX/CMCNP，表明GL表面修飾可增強(qiáng)CMCNP對(duì)PTX的緩釋能力。不同GL取代度的PTX/CMCNP-G

7、L在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率無(wú)顯著性差異。
　　3、載紫杉醇CMCNP-GL的體內(nèi)外靶向性
　　制備羅丹明B(RhB)熒光標(biāo)記納米粒RhB-CMCNP和不同GL取代度的RhB-CMCNP-GL，以肝癌細(xì)胞SMMC-7721與正常肝細(xì)胞L02為細(xì)胞模型，研究納米粒的細(xì)胞黏附、細(xì)胞攝取、攝取機(jī)制與亞細(xì)胞定位。CMCNP-GL在二種細(xì)胞的黏附率和攝取率均顯著高于CMCNP，不同GL取代度的CMCNP-GL在肝癌細(xì)胞的黏附率和攝取率

8、均顯著高于正常肝細(xì)胞，不同GL取代度的CMCNP-GL之間無(wú)顯著性差異。游離GL分子可與肝細(xì)胞表面GL特異性結(jié)合位點(diǎn)相互作用，競(jìng)爭(zhēng)性抑制CMCNP-GL的攝取，對(duì)CMCNP的攝取無(wú)影響，該抑制作用在肝癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞顯著。CMCNP-GL2主要經(jīng)小窩蛋白及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞，攝取過(guò)程具有能量依賴性，且與細(xì)胞的骨架重構(gòu)有關(guān)。GL修飾對(duì)CMCNP的內(nèi)吞途徑無(wú)顯著影響，入胞后主要聚集在細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中。
　　以H-22肝癌荷

9、瘤小鼠為模型，分別考察空白納米粒與載藥納米粒經(jīng)靜脈注射后的體內(nèi)分布，評(píng)價(jià)納米粒的靶向性。結(jié)果表明PTX/CMCNP-GL2可顯著減緩PTX在血液中的清除速率，改善PTX的體內(nèi)分布，聚集于肝臟和腫瘤，顯著降低PTX的心臟和腎臟毒性;PTX/CMCNP-GL2對(duì)肝癌組織的靶向性顯著高于未修飾的PTX/CMCNP和PTX注射液?？瞻纵d體與載藥納米粒的體內(nèi)分布趨勢(shì)一致。
　　4、載紫杉醇CMCNP-GL的體內(nèi)外抗腫瘤功效及安全性
　

10、　以SMMC-7721細(xì)胞為肝癌細(xì)胞模型研究PTX/CMCNP抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力;以H-22肝癌荷瘤小鼠為模型，考察載藥納米粒的體內(nèi)抗腫瘤功效，比較不同GL取代度對(duì)載藥CMCNP體內(nèi)外作用功效的影響。結(jié)果表明PTX/CMCNP-GL可顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的體外增殖，72 h的IC50為2.7～3.2 mg· mL-1，顯著低于PTX注射液(13.5 mg·mL-1)和PTX/CMCNP(8.1mg·mL-

11、1)，不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL之間無(wú)顯著性差異。PTX可誘導(dǎo)一定程度的肝癌細(xì)胞凋亡，24 h的凋亡率均為10～20％，CMCNP納米載體及其GL表面修飾對(duì)PTX引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制和效果無(wú)顯著影響。靜脈注射PTX/CMCNP-GL可有效抑制H-22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腫瘤倍增時(shí)間。PTX/CMCNP-GL的抑瘤效果最佳，平均抑瘤率為87.4％，分別約為PTX注射液和PTX/CMCNP的2.5和1.6倍，表明PTX經(jīng)CM

12、CNP包載后，抗腫瘤效果顯著增強(qiáng)，不同GL取代度PTX/CMCNP-GL的抗腫瘤效果無(wú)顯著差異。
　　考察CMCNP-GL空白載體的細(xì)胞毒性、血液相容性、急性毒性和亞急性毒性，從細(xì)胞、組織和動(dòng)物整體水平初步評(píng)價(jià)CMCNP-GL的安全性。FDA/PI雙染色、LDH、中性紅、蛋白質(zhì)含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞SMMC-7721與不同GL取代度CMCNP-GL(5 mg·mL-1)短時(shí)間（6h或24 h）作用后，胞外L

13、DH釋放量、胞內(nèi)中性紅攝入量、蛋白質(zhì)含量均無(wú)顯著變化，細(xì)胞活力無(wú)顯著影響;MTT試驗(yàn)結(jié)果表明二種細(xì)胞與CMCNP-GL(5 mg·mL-1)較長(zhǎng)時(shí)程(72 h)共培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖率無(wú)顯著影響，CMCNP-GL細(xì)胞毒性低。CMCNP-GL溶血率低于5％，血漿復(fù)鈣時(shí)間較長(zhǎng)，動(dòng)態(tài)凝血率低于硅化玻璃，具有一定的抗凝血效果，血液相容性良好。CMCNP-GL小鼠尾靜脈給藥最大耐受劑量為1800 mg·kg-1;亞急性毒性試驗(yàn)中連續(xù)15天靜脈注射給予