雙配體修飾的殼聚糖納米粒肝癌細(xì)胞主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)第二位惡性腫瘤，每年死亡人數(shù)約11萬(wàn)人，占世界肝癌死亡人數(shù)的40％。因此，在我國(guó)對(duì)肝癌藥物治療方法進(jìn)行深入的研究顯得更為必要。目前研究較熱的肝靶向給藥系統(tǒng)雖然提高了抗癌藥物在肝臟的濃度，降低了藥物對(duì)正常組織器官的毒副作用，卻多數(shù)無(wú)分辨正常肝細(xì)胞與癌變的肝細(xì)胞的能力，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也殺死了正常的肝細(xì)胞，給肝臟功能造成損傷，如能制備一可靶向至肝癌細(xì)胞的給藥系統(tǒng)，則可提高抗癌藥物在肝臟癌變部位的濃度，降低藥物對(duì)正常肝組織的毒副

2、作用，使藥效和治療指數(shù)進(jìn)一步提高。 本課題選擇中藥抗癌有效成分自藜蘆醇為模型藥物，以殼聚糖(CS)為載體材料，制備殼聚糖納米粒(CS-NP)，并在納米粒上連接配體生物素Biotin與抗生物素蛋白Avidin，得到雙配體修飾的納米粒A-B-CS-NP。Avidin的N末端含乙酰半乳糖氨和甘露糖殘基，通過(guò)與肝臟表面半乳糖和甘露糖受體的相互作用，Avidin可介導(dǎo)納米粒靶向至肝臟；Avidin與Biotin對(duì)癌細(xì)胞有特殊的親和力，兩個(gè)

3、配體可進(jìn)一步介導(dǎo)納米粒到達(dá)癌細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向。 為使配體Biotin順利連接到CS上，采用沉淀法制備CS-NP。用單因素法優(yōu)化制備工藝，制得的白藜蘆醇?xì)ぞ厶羌{米粒(Rcs-CS-NP)包封率為65％，載藥量為13％，平均粒徑為300 nm，多分散系數(shù)為0.254，體外釋放行為可用雙指數(shù)雙向動(dòng)力學(xué)描述。沉淀法制備一般常用硫酸鈉溶液作為沉淀劑，制得的微粒粒徑多在u m級(jí)；而本研究以氯化鈉溶液作為沉淀劑，使CS的氨基

4、保持游離，微粒的粒徑達(dá)到nm級(jí)，在制備工藝上具創(chuàng)新性。 使用試劑Sulfo-NHS-Biotin與CS的氨基反應(yīng)生成生物素化的殼聚糖Bio-CS，采用CS-NP的制備工藝制得Biotin修飾的殼聚糖納米粒B-CS-NP；在B-CS-NP溶液中，利用Avidin與Biotin之間有很強(qiáng)的親和力，分別按Biotin：Avidin(2：1)及Biotin：Avidin(1：1)的比例加入Avidin溶液，得到Avidin與Biotin

5、雙配體修飾的納米粒A-B-CS-NP及Avidin修飾的納米粒A-CS-NP。 選用試劑盒，以HABA染料法成功地測(cè)定了包封白藜蘆醇的B-CS-NP及A-B-CS-NP表面Biotin的連接密度，以mmols Biotin／mmols CS為單位，分別為2及1；含藥B-CS-NP平均粒徑為263 nm，多分散系數(shù)為0.170；含藥A-B-CS-NP平均粒徑為319nm，多分散系數(shù)為0.155；兩種納米粒的包封率在65％左右，載藥

6、量在11％左右；體外釋放過(guò)程均符合雙指數(shù)雙向動(dòng)力學(xué)方程。本部分研究選擇簡(jiǎn)單的合成反應(yīng)與結(jié)合途徑，在國(guó)際上率先將分別具有肝靶向及癌細(xì)胞靶向功能的配體Avidin與Biotin連接至CS-NP上，以彌補(bǔ)單一配體修飾載體對(duì)特定組織的特定細(xì)胞靶向能力的不足，增強(qiáng)給藥系統(tǒng)對(duì)肝臟癌細(xì)胞的特異性，并建立了相應(yīng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，構(gòu)思新穎、巧妙、嚴(yán)謹(jǐn)，具較強(qiáng)的創(chuàng)造性。 在動(dòng)物體內(nèi)分布研究中，以白藜蘆醇溶液為對(duì)照，采用HPLC法測(cè)定了各納

7、米制劑經(jīng)小鼠尾靜脈注射后，不同時(shí)間點(diǎn)藥物的體內(nèi)分布情況。含藥CS-NP、B-CS-NP及A-B-CS-NP對(duì)肝臟的相對(duì)靶向效率分別為白藜蘆醇對(duì)照溶液的2.29，1.66及2.54倍，表明Avidin配體的引入提高了納米粒對(duì)肝臟的靶向性，雙配體修飾的A-B-CS-NP具有明顯的肝靶向作用。利用已證實(shí)的Avidin對(duì)肝臟的主動(dòng)靶向性，以Biotin作中介，將Avidin連接至納米粒上，以增強(qiáng)納米粒對(duì)肝臟的靶向能力，此部分研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

8、 用FITC標(biāo)記納米粒，使用酶標(biāo)儀定量考察了人肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況。結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)單配體及雙配體修飾的納米粒的攝取量明顯高于無(wú)配體修飾的納米粒CS-NP(P<0.05)：配體修飾的納米粒存在劑量飽和現(xiàn)象；在高劑量時(shí)，A-B-CS-NP有最大的細(xì)胞攝入量。Avidin或Biotin配體對(duì)細(xì)胞攝取的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，配體修飾的納米粒主要通過(guò)受體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為肝癌細(xì)胞所攝取，雙配體修飾的A-B-CS-NP顯

9、著提高了肝癌細(xì)胞的攝入量，達(dá)到了課題的預(yù)期目的。 以白藜蘆醇溶液為對(duì)照，用MTT法比較了各含藥納米制劑體外對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單配體與雙配體修飾的納米粒對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用明顯高于白藜蘆醇對(duì)照溶液及無(wú)配體修飾的納米粒CS-NP(P<0.05)。在最佳作用濃度點(diǎn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，雙配體修飾的A-B-CS-NP對(duì)細(xì)胞抑制作用顯著高于A(yíng)vidin修飾的A-CS-NP(P<0.05)，與Biotin修飾的B

10、-CS-NP無(wú)明顯差異。由此，從體外藥效學(xué)角度證實(shí)了A-B-CS-NP靶向至肝癌細(xì)胞的有效性。 本研究在國(guó)際上首次成功制備了配體Avidin與Biotin雙重修飾的白藜蘆醇?xì)ぞ厶羌{米粒A-B-CS-NP，建立了該給藥系統(tǒng)體內(nèi)外評(píng)價(jià)方法，通過(guò)體內(nèi)分布，體外細(xì)胞攝取與活性研究證實(shí)了A-B-CS-NP對(duì)肝臟的靶向性，對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用及顯著的殺傷能力。以上研究?jī)?nèi)容國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。此新型給藥系統(tǒng)利用配體Avidin與Bioti