腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的膜包被納米凝膠介導(dǎo)聯(lián)合療法抗腫瘤研究.pdf

1、目的:在近年對聯(lián)合療法的研究中，結(jié)合化療和免疫療法的策略展現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤效果，引起人們對化療免疫療法的高度關(guān)注。然而，化療與免疫治療物質(zhì)的理化性質(zhì)和作用機(jī)理差異較大，想要控制聯(lián)合藥物的劑量與釋放特性，合理的藥物遞送系統(tǒng)就顯得非常重要。
　　方法:在本項(xiàng)研究中，構(gòu)建了一種具有腫瘤微環(huán)境響應(yīng)特性的膜包被納米凝膠，其核心由兩種具有不同電荷的殼聚糖（Chitosan）衍生物和羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）衍生物交聯(lián)組成，用于包載疏

2、水化療藥物紫杉醇（PTX）。另外，在外部包裹紅細(xì)胞膜（RBCm），實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞因子白介素-2（IL-2）的吸附。雙鍵化兩性殼聚糖CECm和季銨化殼聚糖HTCCm通過核磁共振氫譜（1H NMR）和傅利葉變換紅外光譜（FT-IR）確認(rèn)結(jié)構(gòu)。通過1H NMR確證羥丙基-β-環(huán)糊精丙烯酸酯（HP-β-CD-A）結(jié)構(gòu)。通過濁度滴定法，對處方中CECm、HTCCm和HP-β-CD-A的比例進(jìn)行摸索。制備載PTX納米凝膠（NGP），與紅細(xì)胞膜擠壓后，得

3、到載PTX膜包被納米凝膠（NRP）。將NRP與IL-2孵育，構(gòu)建PTX和IL-2共包載的膜包被納米凝膠（NRP+I）。通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態(tài)光散射（DLS）驗(yàn)證紅細(xì)胞膜包被結(jié)構(gòu)。分別通過HPLC和ELISA對PTX和IL-2的裝載效率進(jìn)行檢測。通過TEM和DLS的觀測，對NR的pH響應(yīng)能力進(jìn)行評價(jià)。同時(shí)研究載體的穩(wěn)定性與生物相容性。檢測NR在體外和腫瘤微環(huán)境中的pH響應(yīng)釋藥特性，并對釋放后IL-2的活性進(jìn)行驗(yàn)證。然后對NR中

4、PTX和IL-2的藥代動力學(xué)和體內(nèi)分布進(jìn)行研究。結(jié)合小鼠黑色素瘤模型，對化療免疫療法中PTX的最佳劑量進(jìn)行探索，并以此最佳組合劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。借助腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)與單藥組和其他聯(lián)合藥物組進(jìn)行對比。借助免疫熒光切片，對腫瘤中CD8和CRT分子的表達(dá)進(jìn)行檢測。此外，對小鼠主要臟器和血生化進(jìn)行指標(biāo)，評估體內(nèi)生物安全性。借助免疫組化，對腫瘤CD45、CD8和FOXP3分子進(jìn)行檢測，并通過流式細(xì)胞儀對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤進(jìn)行研究，同時(shí)對腫瘤中

5、細(xì)胞因子水平進(jìn)行評估。不僅如此，將DiR吸附于NRP+I載體膜層（NRP+I+D），以將光熱療法與化療免疫療法進(jìn)行結(jié)合。通過透射電鏡和紫外光譜對DiR的吸附進(jìn)行研究。隨后對載體聯(lián)合組的體內(nèi)外升溫效率進(jìn)行評價(jià)。通過腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)對熱療與化療免疫聯(lián)合載體組的腫瘤抑制效果進(jìn)行研究，并通過流式細(xì)胞儀對腫瘤近端與遠(yuǎn)端淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測。除熱療外，還將一氧化氮供體（TNO3）與化療免疫療法聯(lián)合，對其抗腫瘤和激活免疫細(xì)胞的作用進(jìn)行研究。
　

6、　結(jié)果:成功合成了CECm、HTCCm和HP-β-CD-A，并確定以質(zhì)量比5:1:1制備納米凝膠核心。TEM和Triton X-100實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NRP+I的膜包被結(jié)構(gòu)。NRP+I中PTX和IL-2的包封率經(jīng)檢測分別為73.5±2.2％和89.3±5.4%。同時(shí)NR展現(xiàn)出良好的腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)能力。此外，NR還具有良好的體外穩(wěn)定性和低毒性。在pH7.4條件下，PTX和IL-2的釋放比較緩慢，而在pH6.5環(huán)境下，它們的釋放速度明顯加快。除

7、此之外，NR可以明顯增強(qiáng)藥物在腫瘤中釋放與穿透。并且釋放后IL-2的生物活性沒有受到明顯影響。在藥代動力學(xué)研究中，PTX和IL-2的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和半衰期都有明顯的延長。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，NR可有效遞送藥物至腫瘤部位。此外，劑量探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-2劑量為2.5μg/kg時(shí)，聯(lián)合4mg/kg的PTX可發(fā)揮最強(qiáng)腫瘤抑制效果。與NGP+I和其他給藥方案相比，NRP+I都表現(xiàn)出顯著提升的抗腫瘤效果。免疫熒光切片分析顯示，經(jīng)NRP+I治

8、療后，腫瘤邊緣和深部CRT與CD8的表達(dá)被明顯增強(qiáng)。此外，根據(jù)主要器官H&E切片的觀察和血生化指標(biāo)的分析可知，NR介導(dǎo)的化療免疫療法沒有引起明顯毒副作用。經(jīng)過免疫組化觀察，腫瘤中免疫細(xì)胞（CD45）和CD8細(xì)胞的浸潤被明顯增強(qiáng)，同時(shí)FOXP3細(xì)胞數(shù)量明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析表明，NRP+I促進(jìn)了引流淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中DC的熟化。此外，腫瘤中DCs、輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTLs）和自然殺傷（NK）細(xì)胞的激活與浸潤被明顯

9、增強(qiáng)，活化CTLs/Tregs的比例得到明顯提升。與其他組相比，NR介導(dǎo)化療免疫療法增加了腫瘤中免疫刺激性細(xì)胞因子（IFN-γ和IL-12）的水平，同時(shí)也抑制了免疫抑制性細(xì)胞因子（TGF-β和IL-10）的分泌。然后，在熱療與化療免疫聯(lián)合治療部分，透射電鏡和紫外光譜的結(jié)果表明DiR可高效吸附于膜層，并且不會明顯影響載體結(jié)構(gòu)。經(jīng)過2W/cm2808nm的激光照射（NIR）后，NRP+I+D+NIR在體內(nèi)外都表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的升溫效果。腫瘤抑

10、制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRP+I+D+NIR可明顯減小腫瘤體積，延長小鼠生存期，延緩腫瘤復(fù)發(fā)。此外，NRP+I+D+NIR治療后，腫瘤近端和遠(yuǎn)端淋巴結(jié)中DCs的熟化程度和數(shù)量都得到明顯提升，輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量也得到增加。雙瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光熱療法可增強(qiáng)遠(yuǎn)端未治療腫瘤的抑制效果。總的來說，光熱療法與化療免疫療法結(jié)合，可能增強(qiáng)抗腫瘤效果，增加近端和遠(yuǎn)端淋巴結(jié)中免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。此外，NO供體聯(lián)合療法中，化療免疫療法的腫瘤抑制

11、效果被進(jìn)一步提升，腫瘤中熟化DC、CD3+CD4+、CD3+CD8+和NK細(xì)胞的比例明顯提升。
　　結(jié)論:綜上所述，本研究利用羥丙基-β-環(huán)糊精和兩種帶不同電荷的殼聚糖衍生物，構(gòu)建了一種腫瘤微環(huán)境pH敏感的紅細(xì)胞膜包被納米凝膠。此納米載體可以在不影響藥物生物活性前提下實(shí)現(xiàn)PTX和IL-2的高效裝載，延長藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)藥物在腫瘤部位的穿透。其介導(dǎo)的化療免疫療法可明顯增強(qiáng)抗腫瘤效果，促進(jìn)抗腫瘤免疫效應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫抑制性微環(huán)境。通