基于腫瘤酸性微環(huán)境響應的親疏水性反轉納米凝膠載藥系統(tǒng)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、體內復雜的生理屏障影響著納米載藥系統(tǒng)對抗腫瘤藥物靶向輸送的效率。理想的納米載藥系統(tǒng)需實現(xiàn)血液中的長循環(huán)、腫瘤部位的高度蓄積與深部穿透、腫瘤細胞的有效攝取及胞內定點釋藥,而納米載藥系統(tǒng)的物理化學性質,如粒徑、表面電位、聚乙二醇(poly(Ethylene glycol),PEG)密度及表面功能團等影響其最終生物學效應。體內過程不同階段所處的環(huán)境對納米載藥系統(tǒng)理化性質提出的要求不盡相同,甚至是矛盾的。因此根據粒徑及電荷對納米載藥系統(tǒng)的體內過

2、程影響而發(fā)展的電荷反轉型及粒徑反轉型納米載藥系統(tǒng)得到極大關注,而納米載藥系統(tǒng)表面的親疏水性對體內過程及生物學效應研究卻較少。親水性納米載藥系統(tǒng)通過避免血液中蛋白的吸附及網狀內皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial System,RES)的吞噬作用有利于血液長循環(huán),而疏水性納米載藥系統(tǒng)則通過疏水作用增強與腫瘤細胞膜的相互作用,因而有利于腫瘤細胞的攝取,因此親疏水性反轉型納米載藥系統(tǒng)能有效解決血液長循環(huán)與腫瘤細胞攝取過程中存在的矛盾

3、。PEG有利于增加納米載藥系統(tǒng)的親水性,利用腫瘤酸性微環(huán)境將PEG斷裂有利于增加其疏水性,由此解決PEG困境。但這種親疏水性反轉策略通常依賴于pH誘發(fā)的化學鍵斷裂,常常需要耗費較長時間而影響其最終腫瘤抑制效果的發(fā)揮。同時納米載藥系統(tǒng)親疏水性對其腫瘤組織深部穿透影響未見報道。本課題組前期工作提出利用納米凝膠在微酸性環(huán)境中的親疏水性反轉有利于促進腫瘤細胞對納米凝膠的攝取,同時納米凝膠由于在三維網絡結構中包含大量水分子而具備良好的親水性,而其

4、親疏水性的改變則依賴于結構中功能基團的質子化與去質子化,因此變化迅速。這種基于親疏水性反轉納米凝膠的載藥系統(tǒng)為腫瘤微環(huán)境響應型納米載藥系統(tǒng)研究提供了新的思路。本文構建了pH調控的親疏水性反轉納米凝膠,系統(tǒng)研究其長循環(huán)、腫瘤部位富集及腫瘤深部穿透的影響。為進一步增強納米凝膠載藥系統(tǒng)的抗腫瘤效果,還賦予此載藥納米凝膠pH調控的電荷反轉及GSH(Glutatione,谷胱甘肽)響應的藥物釋放性能,以促進其溶酶體逃逸及胞內GSH響應性釋藥。

5、r>  主要研究內容及結果如下:
  1)通過調節(jié)溫度敏感聚合物N-異丙基丙烯酰胺(N-Isopropyl Acrylamide,NIPAM)、pH敏感N-甲基烯丙基胺(Methylallyl Amine,MAA)和兩性聚離子單體磺基甜菜堿甲基丙烯酸甲酯(Sulfobetaine Methacrylate,SBMA)單體的比例,合成了具有pH調控的親疏水性反轉/電荷反轉能力的PNSM納米凝膠(簡稱為R-納米凝膠)。該凝膠通過N,N

6、'-雙(丙烯酰)胱胺(N,N'-Bis(acryloyl)cystamine),BAC)交聯(lián)而成,交聯(lián)劑中二硫鍵同時也賦予PNSM納米凝膠氧化還原響應性。同時通過調控NIPAM,MAA及SBMA比例合成了無pH調控的親疏水性反轉性能的C-納米凝膠。通過透過率檢測法及粒徑分析法確證了R-納米凝膠在血液及正常組織的生理條件下(pH7.4,37℃)為親水狀態(tài),而在腫瘤酸性微環(huán)境中(pH6.5,37℃)能迅速實現(xiàn)親疏水性反轉。C-納米凝膠則在p

7、H7.4及6.5均為親水狀態(tài)。R-納米凝膠在pH4.5條件下能有效實現(xiàn)電荷反轉,其在溶酶體酸性環(huán)境中具有質子海綿效應。通過有機溶劑揮發(fā)法將阿霉素載入其中,體外釋放實驗表明R-載藥納米凝膠具有pH及GSH響應性。比較了不同pH條件下C-納米凝膠及R-納米凝膠被胎牛血清蛋白的吸附及巨噬細胞Raw264.7的吞噬情況,結果發(fā)現(xiàn)R-納米凝膠pH調控的親疏水性反轉不僅有利于其在pH7.4時有效避免被胎牛血清蛋白吸附及巨噬細胞Raw264.7的吞噬

8、,使其具備血液長循環(huán)的特性,同時促進了HepG2肝癌細胞及H22腫瘤干細胞在pH6.5條件下對R-載藥納米凝膠的攝取及細胞毒性,可有效解決長循環(huán)與腫瘤細胞攝取的矛盾。為了驗證R-載藥納米凝膠胞內GSH響應性釋放藥物特性,我們用谷胱甘肽乙酯(Glutathione Monoethylester,GSH-OEt)對HepG2細胞進行預處理,結果發(fā)現(xiàn)其能有效提高R-載藥納米凝膠的胞內阿霉素熒光強度,并促進R-載藥納米凝膠對HepG2細胞的毒性

9、作用。我們同時關注了PNSM納米凝膠在細胞器中分布,結果發(fā)現(xiàn)pH調控的電荷反轉有利于R-納米凝膠在腫瘤細胞進行溶酶體逃逸,并進一步在胞內GSH的作用下釋放阿霉素。
  2)研究了PNSM納米凝膠在荷瘤小鼠腫瘤部位的蓄積,結果發(fā)現(xiàn)R-載藥納米凝膠在腫瘤組織中的蓄積含量顯著性高于C-載藥納米凝膠及游離阿霉素給藥組,并且具有一定的腫瘤滯留能力。腫瘤組織的深部穿透是影響納米載藥系統(tǒng)發(fā)揮腫瘤抑制作用的重要阻礙,我們也關注了PNSM納米凝膠的

10、腫瘤深部穿透能力。結果表明R-載藥納米凝膠在腫瘤酸性微環(huán)境中的親疏水性反轉有利于其在H22腫瘤細胞團模型、離體腫瘤模型及活體腫瘤中的穿透。
  3)研究了PNSM載藥納米凝膠的腫瘤抑制作用,結果表明在H22荷瘤小鼠模型中,R-載藥納米凝膠對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用顯著性強于C-載藥納米凝膠及游離阿霉素。R-載藥納米凝膠能顯著增強腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖。處于腫瘤深部乏氧區(qū)域的腫瘤干細胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉移有關,因此我們也研

11、究了PNSM載藥納米凝膠對腫瘤干細胞的毒性,結果發(fā)現(xiàn)R-載藥納米凝膠對H22腫瘤干細胞也具有更強的殺傷效果。PNSM納米凝膠本身具有良好的安全性,并能降低負載阿霉素的心臟毒性。
  4)為了進一步確證pH調控的親疏水性反轉策略的有效性及普適性,我們用生物相容性好的溫敏性寡聚乙二醇及pH敏感的丙烯酸(Acrylic Acid,AA)為單體,通過BAC交聯(lián),構建pH調控的親疏水性反轉及氧化還原響應型P(OEGMAs-ss-AA)納米凝

12、膠。研究了pH調控的親疏水性反轉對其蛋白吸附及被腫瘤細胞攝取的影響,結果證實通過腫瘤微環(huán)境中親疏水性反轉策略能有效解決P(OEGMAs-ss-AA)納米凝膠血液長循環(huán)與腫瘤細胞攝取之間的矛盾。我們也深入研究了P(OEGMAs-ss-AA)載藥納米凝膠的胞內命運,結果表明該載藥納米凝膠通過脂筏依賴的內吞途徑及網格蛋白依賴的內吞途徑一同進入Bel7402細胞,在經歷了早期內含體及晚期內含體的傳輸過程后進入溶酶體,而后釋放阿霉素進入細胞核中,

13、最終發(fā)揮細胞毒作用。
  綜上所述,pH調控的親疏水性反轉型納米凝膠在機體的血液及正常組織中為親水狀態(tài),有利于納米凝膠在血液中減少蛋白的吸附及RES的吞噬,因而具有血液長循環(huán)的特性;而在腫瘤酸性微環(huán)境中反轉成為疏水的狀態(tài),有利于其被腫瘤細胞和腫瘤干細胞攝取,因而能有效解決血液長循環(huán)與腫瘤細胞攝取的矛盾。pH調控的親疏水性反轉特性也有利于納米凝膠在腫瘤組織的有效富集及深部穿透。而pH調控的電荷反轉特性則能使納米凝膠在腫瘤細胞胞內溶酶

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