逐級(jí)pH響應(yīng)納米載藥體系的制備及克服腫瘤多藥耐藥性的研究.pdf

1、腫瘤是目前威脅人類生命的最嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90％以上的腫瘤患者是因?yàn)槟退幮远鴮?dǎo)致臨床化療失敗。導(dǎo)致腫瘤耐藥性的原因是多方面的，其中由于腫瘤的快速增長(zhǎng)，腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)出的一些異常現(xiàn)象，如高壓、缺氧、酸性環(huán)境以及新生血管生成現(xiàn)象進(jìn)一步導(dǎo)致了腫瘤的耐藥性。腫瘤間質(zhì)中的高壓現(xiàn)象直接導(dǎo)致抗癌藥物難以進(jìn)入腫瘤組織；腫瘤缺氧環(huán)境會(huì)激活低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）生成而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐受能力增加；而新生血管生成會(huì)促進(jìn)血栓形成并導(dǎo)致血氧供給不通暢。

2、這些特定的腫瘤微環(huán)境為化療藥物到達(dá)腫瘤組織設(shè)置了巨大的障礙。因此，如何增加化療藥物在耐藥腫瘤內(nèi)的有效濃度是治療腫瘤的關(guān)鍵。
　　本課題設(shè)計(jì)并合成多功能逐級(jí)pH響應(yīng)釋藥的納米載藥體系，該體系具有顯著的長(zhǎng)循環(huán)功能。它可以先釋放抗腫瘤血管藥物改善腫瘤微環(huán)境，使腫瘤血管暫時(shí)“正?；保瑸槟[瘤血管給藥提供有利條件，然后增加抗腫瘤藥物在耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度，從而協(xié)同發(fā)揮作用抗多藥耐藥腫瘤。本課題采用抗腫瘤新生血管藥物康普瑞汀A4（CA

3、4）和聚天冬氨酸-肼-阿霉素大分子前藥（Pasp-DOX）作為藥物模型，將具有生物相容性的聚乙二醇-組氨酸共聚物（簡(jiǎn)稱PEG-Phis）作為藥物載體來制備納米載藥膠束。本課題主要對(duì)聚合物的合成及結(jié)構(gòu)確證、納米膠束的制備和制劑學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞毒性、細(xì)胞內(nèi)吞及其內(nèi)吞機(jī)制、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)行為進(jìn)行研究。
　　（1）以聚組氨酸為疏水基團(tuán)，聚乙二醇為親水基團(tuán)，通過開環(huán)聚合反應(yīng)合成不同長(zhǎng)度疏水鏈的聚乙二醇-組氨酸共聚物(簡(jiǎn)稱PEG-Phis

4、20、PEG-Phis40、PEG-Phis60、PEG-Phis80)，采用1H-NMR確證目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)，并采用酸堿滴定法選取在pH5.6-7.1的范圍具有顯著緩沖能力的PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物作為納米藥物載體，同時(shí)采用尼羅紅熒光探針法測(cè)定選取載體的臨界膠束濃度；抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）以pH響應(yīng)斷裂的腙鍵（肼鍵）鍵合到聚天冬氨酸上合成大分子前藥聚天冬氨酸-肼-阿霉素（Pasp-DOX），并采用1H-NM

5、R確證了目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)。
　?。?）以抗血管藥物康普瑞汀（CA4）和聚天冬氨酸-肼-阿霉素（Pasp-DOX）作為藥物模型，以聚乙二醇-組氨酸共聚物 PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物為納米藥物載體，采用一步納米沉淀法制備膠束。以粒徑、包封率以及血清穩(wěn)定性作為指標(biāo)，對(duì)納米膠束的制備工藝和處方條件進(jìn)行優(yōu)化和篩選，并對(duì)納米膠束的制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察。TEM和DLS結(jié)果均顯示，與PEG-Phis40共聚物形成的納米載藥體系

6、相比，PEG-Phis60共聚物形成的納米載藥體系分散性較好、粒徑均一、呈球形，對(duì)CA4和DOX的包封率分別為98.1%和96.1%，而且血清穩(wěn)定性較好，因此優(yōu)選PEG-Phis60制成的納米載藥體系進(jìn)行后續(xù)研究。我們通過體外模擬腫瘤微環(huán)境以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸度值，把PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系加入到不同pH值的酸性環(huán)境進(jìn)行粒徑檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著酸度增加，PEG-Phis60/Pasp-DOX/C

7、A4納米載藥體系的粒徑隨之變大，且TEM檢測(cè)顯示，pH5.0條件下，PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系發(fā)生解膠束行為。采用透析法考察該納米載藥膠束中的CA4和DOX兩種藥物的體外釋放,結(jié)果表明，納米載藥膠束的CA4和DOX的釋放具有pH響應(yīng)性。pH7.4條件下CA4在12h內(nèi)累計(jì)釋放量為8.7%，而在pH6.6條件下CA4發(fā)生突釋，12h累計(jì)釋放64.1%。而DOX的釋放相對(duì)持久，當(dāng)pH變化到5.8，DOX釋放加

8、速，14d累積釋放量達(dá)到57.1%。此種釋藥方式說明該納米載藥體系可以先釋藥改善腫瘤微環(huán)境，使腫瘤血管暫時(shí)“正?；苯o腫瘤血管給藥提供有利條件，然后抗腫瘤大分子前藥進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后斷裂腙鍵釋放抗腫瘤藥物，以此達(dá)到協(xié)同抗腫瘤的目的。
　?。?）以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC作為模擬體內(nèi)腫瘤血管微環(huán)境的細(xì)胞模型，以乳腺癌敏感株MCF-7細(xì)胞（乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR細(xì)胞）作為體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的模型，通過檢測(cè)這兩種細(xì)胞的先后殺傷順序進(jìn)

9、一步證明PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系確實(shí)具有響應(yīng)腫瘤微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞溶酶體的pH而程序釋藥的性質(zhì)。分別以MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞為模型，以CA4、DOX、Pasp-DOX、DOX+CA4、Pasp-DOX+CA4、PEG-Phis60/DOX/CA4等制劑為參照，檢測(cè)PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4的細(xì)胞毒性、細(xì)胞內(nèi)吞及內(nèi)吞機(jī)制等。MTT實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，各制劑均具有一定

10、的抗腫瘤活性，但對(duì)于MCF-7/ADR細(xì)胞，各藥物制劑的抗腫瘤活性表現(xiàn)出很大差異。其中PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4制劑在MCF-7/ADR細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性，能顯著地克服腫瘤的多藥耐藥性。采用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡技術(shù)評(píng)價(jià)了納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4在MCF-7以及MCF-7/ADR細(xì)胞中內(nèi)吞情況，結(jié)果表明納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能顯著提高藥物在

11、耐藥腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)吞，內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)表明兩種納米載藥體系具有不同的入胞方式。
　?。?）采用非房室模型模擬了各制劑在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能夠顯著提高阿霉素藥時(shí)曲線下面積，增加藥物在血漿中的循環(huán)時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的效果，從而能更好地使納米膠束通過EPR效應(yīng)分布到腫瘤區(qū)域發(fā)揮療效。體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能顯著

12、抑制荷耐藥性乳腺癌移植瘤 BALB/C裸鼠的腫瘤增長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)到91.8%。體內(nèi)臟器及腫瘤熒光成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有一定的腫瘤靶向性，而較少分布于正常組織。Masson三原色法和CD31免疫組化染色結(jié)果表明納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有抗腫瘤新生血管生成并顯著改善腫瘤微環(huán)境的作用，小鼠腫瘤切片的TUNEL和H&E染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米載藥膠束PEG-