Legumain響應(yīng)型DOX緩釋體系抑制RB及逆轉(zhuǎn)腫瘤多耐藥性的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　Legumain高表達(dá)是RB（Retinoblatoma,視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤）及其微環(huán)境的重要特征之一?；诖?，我們?cè)O(shè)計(jì)和構(gòu)建 legumain酶響應(yīng)的DOX（Doxorubicin，阿霉素）納米藥物控釋載體，并對(duì)其進(jìn)行表征、優(yōu)化，確定其體內(nèi)外釋放規(guī)律及其對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果，以獲得一種理想的有效抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的藥物載體。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　通過(guò)玻璃體腔注射Y79懸浮細(xì)胞液（Y79是一種較成熟的人類(lèi)RB

2、細(xì)胞株，源自于視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層腫瘤，具有視網(wǎng)膜細(xì)胞的特性）制備RB動(dòng)物模型。使用Trizol試劑和RIPA裂解液分別從Y79細(xì)胞、ARPE細(xì)胞（Adult Retinal Pigment Epithelium, ARPE,是一種廣泛使用的人源視網(wǎng)膜細(xì)胞系）和 RB實(shí)體瘤提取mRNA和蛋白。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot檢測(cè)Legumain蛋白酶在Y79、ARPE以及RB實(shí)體瘤中的表達(dá)水平。結(jié)果表明Legumain在Y7

3、9和RB實(shí)體瘤中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于在A(yíng)RPE中的表達(dá)水平，為后續(xù)Legumain響應(yīng)藥物載體設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。
　　在此項(xiàng)研究中，我們首先設(shè)計(jì)和合成一種 Legumain蛋白酶活化膠束，以L(fǎng)egumain的底物肽（PEP）將親水性聚乙二醇和疏水性聚谷氨酸芐酯（PBG）橋接來(lái)遞送DOX。我們推測(cè)該膠束將在高Legumain活性位點(diǎn)活化釋放，從而增加DOX的靶向性和抗癌活性。通過(guò)核磁共振氫譜（1H-NMR, Varian, USA）和傅里葉

4、轉(zhuǎn)換紅外光譜儀（FT-IR, NICOLET6700, USA）確定共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，凝膠滲透色譜系統(tǒng)（GPC, Malvern, UK）測(cè)定其分子量，高效液相色譜法（HPLC， Agilent, USA）檢測(cè)DOX的包封率和包載率。動(dòng)態(tài)光散射（DLS，Malven, UK）測(cè)量粒徑及其穩(wěn)定性。接著通過(guò)透析法使兩親共聚物自組裝形成膠束。高分辨率透射電子顯微鏡觀(guān)察膠束的形貌。使用游離DOX和包載DOX的膠束處理Y79和RPE細(xì)胞（Reti

5、nal Pigment Epithelium，RPE，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞）并測(cè)定其細(xì)胞毒性。使用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀(Partec, German)進(jìn)一步表征游離DOX與包載DOX的膠束的細(xì)胞攝取量。
　　為了改善藥物釋放的可控性，根據(jù) RB高表達(dá) Legumain的特性，DOX與Legumain底物肽（PEP）綴合形成 DOX-PEP，再進(jìn)一步與琥珀酸苷反應(yīng),在末端添加一個(gè)羧基（DOX-PEP-COOH）。DOX-PEP-CO

6、OH嫁接到殼聚糖骨架結(jié)構(gòu)形成CS-PEP-DOX，在微乳液體系中與京尼平交聯(lián)形成納米顆粒。通過(guò)物理作用將姜黃素（Curcumin, CUR耐藥蛋白抑制劑）包載到納米顆粒的核心形成共包載體系（CS-PEP-DOX/CUR）以進(jìn)一步提高其抗癌效果。經(jīng) MS、FT-IR、DLS、SEM（Phenom-World，The Netherlands）表征和分析中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、粒徑分布和表面形貌。CCK-8法（CCK-8, Doj

7、indo, Japan）測(cè)定游離藥物和包封藥物的細(xì)胞毒性作用，以處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞吸光度百分比計(jì)算細(xì)胞存活率。由于缺少成熟的耐藥型 RB細(xì)胞系，我們采用公認(rèn)的耐藥細(xì)胞模型（MCF-7/ADR）來(lái)評(píng)價(jià)CS-PEP-DOX/CUR納米顆粒逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。在體實(shí)驗(yàn)中，25只3-4周齡的雌性裸鼠多耐藥腫瘤模型構(gòu)建成功。選取其中18只裸鼠隨機(jī)分為3組（即A、B、C組），每組6只。在造模后8w左右，當(dāng)觀(guān)察到有腫瘤形成并可用游標(biāo)卡尺測(cè)量時(shí)，A組、B

8、組、C組分別通過(guò)腹腔注射250μL共包載懸浮液（阿霉素濃度為60μg/ml，姜黃素濃度為100μg/ml），等量的游離阿霉素和游離姜黃素混合液和 PBS平衡鹽溶液。每周測(cè)量和記錄腫瘤大小。使用以下等式計(jì)算腫瘤體積（mm3）:V=a×b2/2（其中a和b分別代表最長(zhǎng)和最短直徑）。取荷瘤裸鼠4只，隨機(jī)再分為兩組，分別腹腔注射250μL Cy5.5熒光探針標(biāo)記的CS-PEP-DOX/CUR懸浮液和250μL Cy5.5熒光探針標(biāo)記的DOX和姜

9、黃素的混合溶液。Maestro2體內(nèi)成像系統(tǒng)在激發(fā)波長(zhǎng)為670 nm處觀(guān)察評(píng)估腫瘤靶向性，近紅外熒光發(fā)射強(qiáng)度為710 nm處的間隔時(shí)間內(nèi)拍照記錄。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　熒光定量PCR研究表明，Legumain在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Y79和正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞ARPE均有表達(dá)，且在Y79中表達(dá)量是ARPE的6-8倍。Western blot實(shí)驗(yàn)表明在RB實(shí)體瘤中Legumain蛋白含量顯著高于A(yíng)RPE。
　　設(shè)計(jì)合成Legm

10、ain響應(yīng)兩親嵌段共聚物，通過(guò)1H-NMR和FT-IR分析，結(jié)果表明該兩親共聚物已經(jīng)成功合成。進(jìn)一步用透析法自組裝包載DOX形成球形納米膠束，直徑約為100 nm。該納米膠束中DOX的釋放速度受Legumain調(diào)配，且與Legumain濃度呈正相關(guān)關(guān)系。納米膠束顯著提高了Y79對(duì)DOX的細(xì)胞攝取量，并且增加了DOX對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性，同時(shí)降低了其對(duì)RPE的細(xì)胞毒性。表明該載體可作為L(zhǎng)egumain高表達(dá)腫瘤的藥物載體。
　　為了增加

11、藥物釋放的可控性，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)制備了Legumain響應(yīng)的化學(xué)鍵合包載的藥物載體。我們首先合成了DOX多肽（Legumain底物多肽）衍生物（DOX-PEP）。核磁共振、紅外以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明我們已經(jīng)成功合成了DOX-PEP。我們將DOX-PEP進(jìn)一步嫁接至殼聚糖（Chitosan, CS）上，優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，考察不同催化體系對(duì)嫁接效率的影響。結(jié)果表明，EDC/DMAP催化得到較高的催化效果。在微乳化的溶劑體系中交聯(lián)形成粒徑約為400 n

12、m，帶正電的非球形納米粒子。該納米藥物（CS-PEP-DOX納米藥物）能夠顯著增加DOX對(duì)Y79的抑制效率。為了進(jìn)一步提高DOX的抗癌效率，我們將CUR（Curcumin，CUR,姜黃素）進(jìn)一步包載到 CS-PEP-DOX納米藥物疏水核心，形成共包載藥物體系（CS-PEP-DOX/CUR納米藥物）。研究CS-PEP-DOX/CUR納米藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤多耐藥性的效果。結(jié)果表明，CUR能夠顯著增加 Y79細(xì)胞對(duì) DOX的敏感性。CS-PEP-D

13、OX納米粒子對(duì)Y79的抑制率從游離DOX的5％提高到25%。共包載CUR后對(duì)Y79的抑制率進(jìn)一步調(diào)高到35%。由于Y79并非耐藥細(xì)胞模型，我們進(jìn)一步用成熟的耐藥型細(xì)胞系 MCF-7/ADR進(jìn)一步評(píng)價(jià) CS-PEP-DOX/CUR納米藥物逆轉(zhuǎn)多耐藥性的效果，結(jié)果顯示1.8μg/mL DOX處理濃度下， CS-PEP-DOX納米粒子對(duì)MCF-7/ADR的抑制率從游離DOX的5%提高到35%。共包載CS-PEP-DOX/CUR進(jìn)一步提高藥物的

14、處理效果，對(duì)MCF-7/ADR的抑制率進(jìn)一步調(diào)高到57%。我們制備了裸鼠腫瘤模型用于評(píng)價(jià)CS-PEP-DOX/CUR納米藥物的治療效果。結(jié)果表明CS-PEP-DOX/CUR納米藥物能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果，表現(xiàn)出較好的治療效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　本研究設(shè)計(jì)合成了Legumain響應(yīng)的兩親共聚物，自組裝包載DOX形成的納米膠束（疏水相互作用載藥）。該藥物載體能夠促進(jìn)Y79對(duì)DOX的吸收，增強(qiáng) DOX對(duì) Y79的抑制效果。

15、同時(shí)，本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)制備了基于殼聚糖的Legumain響應(yīng)DOX載體（化學(xué)鍵合載藥），結(jié)果表明該納米藥物能夠顯著增加DOX對(duì)Y79的抑制效果。為了使藥物載體具有逆轉(zhuǎn)多耐藥性的效果，我們將CUR（耐藥蛋白抑制劑）共包載形成CS-PEP-DOX/CUR納米顆粒。該載體能夠進(jìn)一步增加 DOX對(duì) Y79的處理效果。同時(shí)，相比 CS-PEP-DOX納米顆粒， CS-PEP-DOX/CUR納米顆粒能顯著增強(qiáng)對(duì)耐藥型腫瘤的抑制效率（細(xì)胞水平和動(dòng)物水