紫龍金克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的機(jī)制和全氟壬酸對(duì)大鼠肝臟免疫毒性的研究.pdf

1、1、中藥紫龍金克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的機(jī)制
　　 復(fù)方中藥紫龍金(Zilongjin,ZLJ)是一種新型的抗癌中藥,在臨床上廣泛應(yīng)用于胃癌,結(jié)腸癌,乳腺癌等常見(jiàn)腫瘤的治療,具有良好的臨床抗癌療效。多藥耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致化學(xué)藥物治療腫瘤失敗的主要原因之一,目前已經(jīng)成為臨床腫瘤治療中的主要障礙。ZLJ與腫瘤多藥耐藥性的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道,為拓展其用途,本研究觀察中藥ZLJ對(duì)于克服腫瘤多藥耐藥性的作用機(jī)制。
　　 我們選擇具有顯著

2、耐藥性特征的兩對(duì)細(xì)胞株,人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX和人口腔上皮癌耐藥細(xì)胞 KBV200以及對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞株MCF-7、KB作為研究載體,ZLJ處理這兩對(duì)細(xì)胞。MTT法檢測(cè)ZLJ對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示:敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞對(duì)ZLJ的IC50值相近,依次為0.69±0.055 mg/ml和0.65±0.030 mg/ml,0.61±0.078 mg/ml和0.59±0.035 mg/ml,表明MCF-7/DOX和KBV200對(duì)ZL

3、J均沒(méi)有交叉耐藥性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,羅丹明123熒光以及活性氧自由基變化,結(jié)果顯示ZLJ對(duì)敏感和耐藥細(xì)胞均有S期阻斷作用,高濃度ZLJ處理后羅丹明123熒光強(qiáng)度有所升高,認(rèn)為其有微弱的逆轉(zhuǎn)耐藥性作用,ZLJ處理后檢測(cè)活性氧自由基沒(méi)有變化。ZLJ分別與多柔比星 DOX和長(zhǎng)春新堿VCR合用,可以明顯地增加DOX和VCR的活性。Western blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白的變化,隨著時(shí)間的增加,MCF-7/DOX中耐藥蛋白P-糖蛋白

4、和抑癌基因蛋白 p53的表達(dá)逐漸降低,同時(shí),在高劑量下,凋亡標(biāo)志蛋白PARP出現(xiàn)切割。
　　 研究表明:復(fù)方中藥ZLJ抑制耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX和KBV200增殖,對(duì)其沒(méi)有交叉耐藥性；ZLJ的抑制作用與阻斷細(xì)胞S期DNA的合成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及降低P-gp的表達(dá)有關(guān)。
　　 2、Kupffer細(xì)胞(KC)介導(dǎo)的全氟壬酸對(duì)大鼠肝臟免疫毒性的研究
　　 近年來(lái),PFNA的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,自然界中野生動(dòng)物及環(huán)境介質(zhì)

5、中檢測(cè)到的PFNA含量也逐漸升高。對(duì)PFNA的研究較多的是肝臟毒性,生殖與發(fā)育毒性,而對(duì)PFNA的免疫毒性的研究相對(duì)較少。
　　 KC是肝血竇內(nèi)的吞噬細(xì)胞,具有吞噬、分泌、參與免疫等功能。KC通過(guò)調(diào)節(jié)應(yīng)激及代謝相關(guān)的酶積極參與肝細(xì)胞的解毒功能。本論文就是研究KC介導(dǎo)的PFNA對(duì)大鼠肝臟免疫毒性的機(jī)制。主要結(jié)論如下:
　　 選擇雄性SD大鼠作為研究對(duì)象,分別單獨(dú)暴露PFNA組,以及同時(shí)暴露PFNA和KC抑制劑GdCl3(每

6、隔兩天注射一次)14天后,單獨(dú)暴露組肝臟組織中炎性因子TNFα、IL-1β的分泌量顯著增加,而PFNA和GdCl3共同暴露組TNFα、IL-1β的含量與對(duì)照組水平相當(dāng)。同時(shí),活體暴露后灌流法分離的KC中TNFα、IL-1β的基因表達(dá)水平也明顯升高。此外,體外PFNA單獨(dú)暴露KC后,TNFα、IL-1β的分泌水平也顯著性上升。
　　 單獨(dú)暴露PFNA及同時(shí)暴露PFNA和GdCl3后分離肝細(xì)胞,分析其基因表達(dá)情況。結(jié)果表明,在PFN

7、A存在的條件下,KC的失活使得基因PPARα的表達(dá)升高,PPARα下游基因CPT-1,CTE-1,MTE-1均出現(xiàn)相似的趨勢(shì)。體外單獨(dú)暴露PFNA以及PFNA分別和IL-1β、TNFα共同暴露,結(jié)果表明單獨(dú)暴露組基因PPARα表達(dá)顯著升高,其共同暴露組的表達(dá)卻顯著性下降,表明KC是在PFNA的刺激下產(chǎn)生大量的IL-1β和TNFα,而IL-1β和TNFα可以抑制PPARα的表達(dá)。TNFα與IL-1β的趨勢(shì)相似,共培養(yǎng)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

8、
　　 轉(zhuǎn)染含有PPARα啟動(dòng)子的質(zhì)粒,分別用TNFα和IL-1β處理,結(jié)果顯示處理組PPARα表達(dá)水平均下降,這說(shuō)明TNFα和IL-1β能在分子水平上抑制PPARα啟動(dòng)子的表達(dá)。轉(zhuǎn)染NF-κB質(zhì)粒,分別用PFNA,WY14643,TNFα和IL-1β處理,結(jié)果表明TNFα和IL-1β處理組的NF-κB表達(dá)顯著性增加,表明KC在PFNA的刺激下,產(chǎn)生IL-1β和TNFα,IL-1β和TNFα是通過(guò)刺激NF—κB通路的高表達(dá)來(lái)抑制

9、PPARα的表達(dá),這一過(guò)程并非靠PFNA本身的抑制作用。用NF-κB的亞基p65和PPARα啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染,用TNFα和IL-1β處理,共轉(zhuǎn)染組的PPARα表達(dá)水平明顯下降。同時(shí),用NF-κB抑制劑處理原代肝細(xì)胞后,PPARα表達(dá)水平明顯升高,這些結(jié)果都證實(shí)了TNFα和IL-1β刺激NF-κB通路的高表達(dá)。
　　 綜上所述,PFNA暴露后,KC在介導(dǎo)肝臟毒性方面發(fā)揮了重要的作用,通過(guò)分泌大量的IL-1β和TNFα,從而激活NF-κ