靈芝酸T聚合物納米膠束的構(gòu)建及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、近年來，聚合物因其優(yōu)異的可設(shè)計(jì)性和良好的生物相容性等特點(diǎn)作為藥物輸送載體備受關(guān)注。研究表明，靈芝是一種著名的傳統(tǒng)中草藥，從靈芝中提取的生物活性物質(zhì)靈芝酸T(GA-T)具有顯著的抗腫瘤作用。然而，因其難溶于水限制了其應(yīng)用。本文應(yīng)用分子自組裝技術(shù)構(gòu)建了兩類水分散性良好的靈芝酸T聚合物納米膠束，研究了其分別對(duì)人肺癌95-D細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制效果，并對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究報(bào)告的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下

2、:
　　 1.超支化聚乙二醇/靈芝酸T納米膠束的構(gòu)建及其對(duì)人肺癌95-D細(xì)胞的作用機(jī)制研究
　　 我們用二丙烯酸寡聚乙二醇酯(PEG-DA)和1，8-二氨基-3，6-二氧雜辛烷(EOBEA)進(jìn)行邁克爾加成聚合，再用二乙胺封端過量的雙鍵，得到陽離子型超支化聚乙二醇(HPEG)。用核磁共振(NMR)和傅立葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)HPEG的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。
　　 用MTT法評(píng)估了HPEG對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3

3、T3細(xì)胞)的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，2 mg/mL的HPEG作用于NIH-3T3細(xì)胞24小時(shí)，NIH-3T3細(xì)胞的存活率為65％，說明HPEG具有很低的細(xì)胞毒性。借助流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)攝觀察，發(fā)現(xiàn)HPEG僅需5分鐘就可進(jìn)入人肺癌95-D細(xì)胞。
　　 進(jìn)一步采用分子自組裝技術(shù)構(gòu)建了超支化聚乙二醇/靈芝酸T(HPEG/GA-T)納米膠束。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)觀察表明，HPEG/GA-T納米膠束的粒

4、徑小于200 nm，適宜作為藥物輸送系統(tǒng)。MTT檢測(cè)表明，GA-T濃度為50μg/mL的HPEG/GA-T納米膠束作用于人肺癌95-D細(xì)胞24小時(shí)，人肺癌95-D細(xì)胞的死亡率為93％，HPEG/GA-T納米膠束能夠顯著抑制人肺癌95-D細(xì)胞的生長(zhǎng)。Hoechst33342染色法檢測(cè)表明，GA-T濃度為50μg/mL的HPEG/GA-T納米膠束作用于人肺癌95-D細(xì)胞16小時(shí)，誘導(dǎo)人肺癌95-D細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，HPEG/GA-T納

5、米膠束誘導(dǎo)人肺癌95-D細(xì)胞早期凋亡。
　　 2.聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯/靈芝酸T納米膠束的構(gòu)建及其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用機(jī)制研究
　　 用辛酸亞錫作催化劑，以聚乙二醇(PEG)引發(fā)ε-己內(nèi)酯(ε-CL)開環(huán)聚合，合成了聚乙二醇與聚己內(nèi)酯的兩嵌段聚合物(PEG-b-PCL)。用核磁共振(NMR)和傅立葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)PEG-b-PCL的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。采用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估了PEG-b-PCL對(duì)小鼠成纖維細(xì)

6、胞（NIH-3T3細(xì)胞）的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mg/mL的PEG-b-PCL作用于NIH-3T3細(xì)胞24小時(shí)，NIH-3T3細(xì)胞的存活率為85％，PEG-b-PCL具有很低的細(xì)胞毒性。
　　 進(jìn)一步采用分子自組裝技術(shù)構(gòu)建了PEG-b-PCL/GA-T納米膠束，透射電鏡觀察表明，PEG-b-PCL/GA-T納米膠束的平均粒徑為95 nm，很適宜作為藥物輸送系統(tǒng)。MTT檢測(cè)表明，GA-T濃度為50μg/mL的PEG-b-PC

7、L/GA-T納米膠束作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48小時(shí)，HeLa細(xì)胞的死亡率為98％，PEG-b-PCL/GA-T納米膠束能夠有效抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。Hoechst33342染色法檢測(cè)表明，GA-T濃度為50μg/mL的PEG-b-PCL/GA-T納米膠束作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞24小時(shí)，誘導(dǎo)了人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，PEG-b-PCL/GA-T納米膠束誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞早期凋亡。
　　 用真

8、核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-EGFP-TRAIL轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，結(jié)果表明TRAIL誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步將TRAIL與PEG-b-PCL/GA-T納米膠束聯(lián)合應(yīng)用于HeLa細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯/靈芝酸T納米膠束對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制研究
　　 采用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估了PEG-b-PCL/GA-T納米膠束對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GA-T濃度為50μ

9、g/mL的PEG-b-PCL/GA-T納米膠束作用于人肝癌HepG2細(xì)胞48小時(shí)，HepG2細(xì)胞的死亡率為66％，PEG-b-PCL/GA-T納米膠束對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率較低。Hoechst33342染色法檢測(cè)表明，GA-T濃度為50μg/mL的PEG-b-PCL/GA-T納米膠束作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24小時(shí)，不誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。用PEG-b-PCL/GA-T納米膠束處理穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的人肝癌He