抗腫瘤載紫杉醇-四羧基鋅酞菁pH敏感聚合物膠束的研究.pdf

1、光動(dòng)力學(xué)療法（photodynamic therapy，PDT）指特定波長(zhǎng)光線激發(fā)光敏劑至激發(fā)態(tài)，后者衰減時(shí)將能量傳遞給周圍氧氣分子，產(chǎn)生活性氧，破壞周圍生物大分子結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PDT主要用于淺表疾病治療，如銀屑病、黃斑病變、膀胱癌。第二代光敏劑多為酞菁類化合物，水溶性差，限制了其應(yīng)用。本文采用納米給藥系統(tǒng)----聚合物膠束包裹光敏劑和化療藥物，依據(jù)增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)（EPR）將兩種藥物靶向輸送至黑色素瘤，并由于pH敏感性，可

2、較快釋放藥物到腫瘤組織，施加特定波長(zhǎng)激光后，可激發(fā)光敏劑，同時(shí)產(chǎn)生光動(dòng)力學(xué)和化療作用，高效抑制腫瘤生長(zhǎng)。-本文采用實(shí)驗(yàn)室合成的pH敏感共聚物——甲氧基聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯-聚己內(nèi)酯（mPEG-pDEA-PCL, PDP）和甲氧基聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯（mPEG-pDEA, PD）作為基本材料分別構(gòu)建了三嵌段聚合物膠束和二嵌段聚合物膠束，并包裹實(shí)驗(yàn)室合成的新型光敏劑——四羧基鋅酞菁（zincβ-t

3、etra-(4-carboxylbenzyloxyl)phthalocyanine, ZnPC4）和抗腫瘤藥物紫杉醇。本文考察了ZnPC4的光物理學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性（抗菌性能），以及包裹光敏劑和化療藥的pH敏感聚合物膠束抗黑色素瘤的體內(nèi)外藥效和體內(nèi)靶向性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴ZnPC4的光物理學(xué)性質(zhì)。用紫外可見分光光度法測(cè)定ZnPC4摩爾吸光系數(shù)，用熒光分光光度法測(cè)定ZnPC4的熒光量子產(chǎn)率，用單線態(tài)氧（1O2）捕捉分子探針

4、9,10-二甲基蒽（DMA）間接測(cè)定ZnPC4的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率。ZnPC4的N,N’-二甲基甲酰胺（DMF）溶液的最大吸收波長(zhǎng)為680nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)616nm。采用660nm激光器激發(fā)，發(fā)現(xiàn)ZnPC4的單線態(tài)量子產(chǎn)率高于傳統(tǒng)鋅酞菁，而熒光量子產(chǎn)率低于鋅酞菁，同時(shí)由于激發(fā)波長(zhǎng)較大，可穿透較厚生物屏障，可成為高效光敏劑用于光動(dòng)力學(xué)治療。⑵ZnPC4的光動(dòng)力學(xué)抗菌性能。將一定濃度的菌液與ZnPC4暗孵育一定時(shí)間，用660nm激光照射1次

5、，采用平皿法鋪板，分別考察ZnPC4對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）的光動(dòng)力學(xué)體外抗菌性能。ZnPC4對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的光動(dòng)力學(xué)抑菌效果（PACT），同時(shí)暗毒性較小；對(duì)大腸桿菌的PACT一般；對(duì)白色念珠菌的PACT較好。本實(shí)驗(yàn)證明了ZnPC4具有明顯的光動(dòng)力學(xué)活性。⑶載藥pH敏感聚合物膠束的制備和性質(zhì)。分別

6、用紫杉醇、ZnPC4或兩者合用為模型藥物，用四氫呋喃超聲注入法制備載藥PDP、PD聚合物膠束，揮去溶劑，得到均勻的膠束。透射電鏡發(fā)現(xiàn)聚合物膠束為納米級(jí)。用激光粒度儀測(cè)定了不同pH（4.5～8.0）下膠束的粒徑和zeta電位，發(fā)現(xiàn)膠束的平均粒徑和zeta電位呈pH依賴性，在弱酸性下粒徑較大，電位為正電性，在中性和弱堿性下粒徑較小，電位為負(fù)電性，非常有利于包裹藥物和在腫瘤低pH條件下釋放藥物。以載藥量和包封率為指標(biāo)，篩選得到聚合物膠束的最優(yōu)

7、處方為：三嵌段聚合物膠束， PDP/ZnPC4/PTX=5:1:1（w/w/w），紫杉醇包封率為55.60％，載藥量為6.05%；二嵌段聚合物膠束，PD：ZnPC4：PTX=5:1:0.5（w/w/w），紫杉醇的包封率為76.81%，載藥量為2.89%。包封率和載藥量均較高，可滿足體內(nèi)給藥需求。⑷紫杉醇和ZnPC4的含量測(cè)定方法。建立高效液相色譜法測(cè)定紫杉醇的含量，進(jìn)行方法學(xué)確證。建立紫外可見分光光度法測(cè)定ZnPC4的含量，進(jìn)行方法學(xué)確

8、證。⑸載藥pH敏感聚合物膠束的體外抗腫瘤藥效。選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2和小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16-F10作為模型，考察載藥pH敏感聚合物膠束在細(xì)胞水平的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。先將聚合物膠束和細(xì)胞暗孵育4h，然后用9J激光（660nm）照射60秒，培養(yǎng)24h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率，發(fā)現(xiàn)空白膠束對(duì)細(xì)胞的毒性很小，PTX和ZnPC4游離藥物的抗腫瘤效果較差，而載PTX和ZnPC4的pH敏感聚合物膠束較游離藥物的抗腫瘤效果有很大提升，說(shuō)明PDP和

9、PD聚合物是良好的藥物載體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)共載藥膠束的藥效強(qiáng)于單獨(dú)載紫杉醇和ZnPC4的膠束，載ZnPC4聚合物膠束的暗毒性小，單獨(dú)光照也不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。用分子生物學(xué)方法考察了載藥聚合物膠束的藥效機(jī)制，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞首先吞噬膠束，照射后導(dǎo)致線粒體膜電位急劇降低，并引起細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力學(xué)和化療具有協(xié)同效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)為體內(nèi)抗腫瘤研究提供了依據(jù)。⑹載藥pH敏感聚合物膠束的體內(nèi)抗腫瘤藥效。建立BALB/c裸鼠皮下黑色素瘤模型，小動(dòng)物活體成像儀實(shí)時(shí)監(jiān)