HBVpreS1多肽(2-21 Aa)介導(dǎo)肝臟靶向納米脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的研究.pdf

1、研究背景:
　　肝臟是人體能量轉(zhuǎn)換、消化、排泄、免疫和解毒等過程的重要器官。肝臟疾病是臨床常見的多發(fā)病,病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及原發(fā)性肝癌等極大地影響著人類的健康。我國是肝病的重災(zāi)區(qū),約有1.2億乙肝病毒攜帶者和1000萬例丙肝感染者,有研究表明近80％的原發(fā)性肝癌都是由病毒性肝炎引起[1]。目前臨床肝病的治療手段包括外科手術(shù)、肝移植術(shù)和藥物治療等[2]。藥物作為重要的治療策略,其目的主要是到達病變部位、清除致病因子、修復(fù)

2、受損的肝細胞。然而目前大多數(shù)肝病治療藥物由于肝臟分布少、藥代動力學(xué)性質(zhì)差、毒副作用大等缺點,應(yīng)用受到了很大的限制。因此,探索肝病治療的有效方法和策略是目前亟需解決的重大難題[3]。
　　肝靶向給藥系統(tǒng)(Hepatic targeted drug delivery systems, HTDDS)是一種可以緩釋和控釋藥物的新型策略,能夠?qū)⑺幬镉行У剡f送到肝臟的病變部位,最大程度地發(fā)揮藥物的治療效果,降低毒副作用,減少給藥次數(shù)和用藥量,

3、提高了藥物的治療指數(shù)、局部濃度和治療效果,對肝病的治療具有積極的推動作用,是近年來肝病靶向治療領(lǐng)域研究的熱門[4]。HTDDS可分為主動型和被動型兩種,被動型一般是采用生物相容性好、毒性低的聚合材料裝載藥物,利用體循環(huán)代謝中的“增強滲透保留”效應(yīng)(Enhanced permeation and retention effect, EPR)和肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬攝取作用發(fā)揮靶向傳遞的功能。主動型是對載體進行一定的靶向修飾,定向地將藥物傳

4、遞到特定的組織和細胞,常見的模式是利用配體-受體或抗原-抗體的特異性結(jié)合發(fā)揮作用。
　　研究內(nèi)容:
　　隨著對肝臟組織結(jié)構(gòu)認識地加深,人類不斷發(fā)現(xiàn)肝臟細胞新的靶點,為肝病的靶向治療提供了更多新的作用位點。運用質(zhì)譜分析加雙重親和純化的技術(shù),我國科學(xué)家成功揭示了鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽(Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide, NTCP)是HBV和HDV的功能性受體,所用的

5、靶向探針是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)表面抗原PreS1中的一段多肽[5]。
　　HBV是嗜肝類DNA毒科中的一員,其外膜蛋白的preS1段在HBV與肝細胞特異性結(jié)合中必不可少,其中與肝細胞特異性結(jié)合位點位于第2-48氨基酸肽段中。文獻報道:進行乙?；投罐Ⅴ；揎椀膒re-S1特殊肽段可成功阻斷HBV對人類原代肝細胞(primary human hepatocytes,PHH)、樹鼩原代肝細胞(p

6、rimary tupaia hepatocytes,PTH)和經(jīng)過誘導(dǎo)分化的HepRG細胞的感染。HBVpreS1的第9-21位氨基酸是具有結(jié)合阻斷能力的高度保守序列,豆蔻酰化修飾的HBVpreS1/2-21myr是有效阻斷抑制的最短多肽,其序列為myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-NH2。這提示我們 HBVpreS1是與肝細胞表面受體NTCP特異性結(jié)合的配體序列,利用其受體與配體特異性結(jié)合作用,可以設(shè)計出HBVpreS1

7、/2-21myr介導(dǎo),肝細胞表面NTCP受體靶向的新型肝靶向給藥系統(tǒng)。
　　研究方法:
　　課題的總體設(shè)計為以 HBVpreS1/2-21myr為靶向介質(zhì),以長效循環(huán)脂質(zhì)體(long circulating liposomes,LCL)為藥物載體,熒光素鈉(Fluorescein Sodium,FS)作為熒光模式評價藥物,采用乙醇注入法制備肝細胞 NTCP受體靶向的新型藥物遞送系統(tǒng)HBVpreS1/2-21myr-FS-LC

8、L。
　　首先,采用微波多肽固相合成法合成 HBVpreS1多肽(2-21Aa),序列為 NH2-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-COOH,利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)和離子肼質(zhì)譜(Ion Trap Mass Spectrometry,ITMS)對多肽產(chǎn)物進行表征,進一步進行乙酰化和豆蔻?；揎?/p>

9、得到多肽 HBVpreS1/2-21myr。然后分別進行異硫氰酸熒光素(FITC)的熒光標(biāo)記和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺(DSPE-PEG2000-Mal)的磷脂基團修飾,熒光標(biāo)記的多肽 HBVpreS1/2-21myr-FITC用于多肽靶向性的驗證,磷脂基團修飾的多肽產(chǎn)物HBVpreS1/2-21myr-PEG2000-DSPE,將作為脂質(zhì)體合成的原料與大豆磷脂、膽固醇等脂質(zhì)體配方成分混合一起,加熱并制備脂質(zhì)體

10、。
　　其次,制備的熒光素鈉靶向脂質(zhì)體 HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL和普通脂質(zhì)體FS-LCL運用透射電子顯微鏡(Transimission electron microscope,TEM)觀察納米脂質(zhì)體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu),激光粒度儀測量脂質(zhì)體粒徑大小和分布,HPLC檢測脂質(zhì)體的包封率,并對高壓均質(zhì)機處理的影響和脂質(zhì)體穩(wěn)定性做了進一步的研究。此外,通過RT-PCR和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達NTCP的HepG2-N

11、TCP、LO2-NTCP和HEK293-NTCP細胞,原代肝細胞活體分離的方法獲得樹鼩原代肝細胞和大鼠原代肝細胞。這些細胞將作為體外細胞靶向評價模型分析熒光多肽 HBVpreS1/2-21myr-FITC和熒光素鈉靶向脂質(zhì)體 HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的肝臟靶向性。將熒光多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC與上述細胞模型孵育培養(yǎng),以流式細胞術(shù)和共聚焦顯微鏡進行觀察和檢測,RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染的細胞中N

12、TCP的表達,從蛋白水平和mRNA水平驗證細胞模型構(gòu)建成功。
　　最后,將包裹有熒光素鈉的靶向納米脂質(zhì)體 HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL、對照的普通脂質(zhì)體組FS-LCL和熒光素鈉水溶液FS,分別與上述細胞進行孵育培養(yǎng),以流式細胞技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析納米脂質(zhì)體的肝靶向性。
　　研究結(jié)果:
　　(1)固相法合成的HBVpreS1多肽(2-21Aa)純度較高,合成工藝簡單、操作方便,合成效率高;高效液相

13、色譜、質(zhì)譜和離子肼質(zhì)譜表征結(jié)果提示合成的多肽產(chǎn)物與設(shè)計的多肽序列GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP分子量大小一致,序列吻合;
　　(2)成功進行了FITC的熒光標(biāo)記和DSPE-PEG2000-Mal的磷脂基團修飾;
　　(3)熒光標(biāo)記的多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC具有肝細胞NTCP受體靶向性;
　　(4)制備的熒光素鈉靶向納米脂質(zhì)體HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL粒徑大小合適,平均

14、值為(94.09±9.2) nm;脂質(zhì)體包封率較高為(89.32±1.02)%;制備工藝操作方便、簡單高效,穩(wěn)定性好;
　　(5)構(gòu)建的HepG2-NTCP、LO2-NTCP、HEK293-NTCP細胞和活體分離培養(yǎng)的樹鼩原代肝細胞可作為HBVpreS1/2-21myr和HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的體外靶向評價模型;
　　(6)制備的熒光素鈉靶向納米脂質(zhì)體HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL具有

15、肝細胞NTCP受體靶向性。
　　研究結(jié)論:
　　通過本實驗,我們證實了 HBVpreS1/2-21myr與表達有 NTCP的 HepG2-NTCP、LO2-NTCP和 HEK293-NTCP細胞,以及樹鼩的原代肝細胞有明顯地特異性結(jié)合, HBVpreS1/2-21myr修飾的納米脂質(zhì)體 HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL與對照組相比,通過NTCP與HBVpreS1的受體-配體結(jié)合作用,可以高效地遞送更多的熒光素鈉