輔酶Q-,10-納米脂質(zhì)體的研究.pdf

1、輔酶Q<,10>(coenzyme Q<,10>，CoQ<,10>)是一種人體自行合成的苯醌化合物，可通過(guò)電子傳遞鏈加速產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)，同時(shí)也是人體細(xì)胞膜中廣泛存在的唯一內(nèi)源親脂性抗氧化劑，它對(duì)延緩衰老、提高機(jī)體免疫力有著特殊的意義。但CoQ<,10>不溶于水、口服生物利用度低，這一特性極大地限制了它的應(yīng)用。以納米脂質(zhì)體作為輸送系統(tǒng)是改善CoQ<,10>等親脂性營(yíng)養(yǎng)物的水溶性并提高其口服生物利用度的可能途徑。 本論文系

2、統(tǒng)研究了納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>的分析方法、CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的制備工藝和配方、貯存穩(wěn)定性，探討了CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定機(jī)理；以Caco-2細(xì)胞為小腸吸收模型，研究了納米脂質(zhì)體對(duì)CoQ<,10>在攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用，并進(jìn)一步研究了CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的大鼠口服吸收動(dòng)力學(xué)。 首先，建立了分析納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>總量的吐溫80增溶-紫外分光光度法。非離子表面活性劑吐溫80作為增溶劑可將包埋在納

3、米脂質(zhì)體雙分子層中的CoQ<,10>有效釋放，溶質(zhì)CoQ<,10>的表觀溶解度與吐溫80的濃度呈正相關(guān)，增溶CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的較佳吐溫80濃度為1％(w/v)。紫外分光光度法測(cè)定經(jīng)吐溫80增溶的納米脂質(zhì)體體系中CoQ<,10>含量時(shí)，還原劑硼氫化鈉(7 mg/mL)的用量為1 mL，反應(yīng)時(shí)間為40～50 min。采用紫外分光光度法對(duì)CoQ<,10>進(jìn)行定量檢測(cè)與高效液相色譜法在2.5～50μg/mL 的CoQ<,10>濃度范圍

4、內(nèi)具有良好的相關(guān)性(R<'2>>0.999)。與傳統(tǒng)的混合溶劑(甲醇/正己烷)萃取-紫外分光光度法相比，吐溫80增溶-紫外分光光度法在保證準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，具有省去繁瑣耗時(shí)的溶劑萃取預(yù)處理過(guò)程、避免使用有毒有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)，為納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>總量的測(cè)定提供了一種新方法。 通過(guò)比較納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>的包封率及其產(chǎn)品的穩(wěn)定性，確定采用乙醇注入-超聲法在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備CoQ<,10>納米脂質(zhì)體。以包封率、保留

5、率、平均粒徑以及平均粒徑變化率為指標(biāo)，經(jīng)優(yōu)化得到的較佳制備工藝參數(shù)為：乙醇2 mL，攪拌時(shí)間20 min，水化溫度55℃，超聲功率400 W。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的較佳配方為：蛋黃磷脂/膽固醇/吐溫80/CoQ<,10>(2.5：0.4：1.8：1.2，w/w)，水化介質(zhì)為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，0.15 mol/L NaCl)。該條件下制得的脂質(zhì)體絕大部分在20～300

6、nm之間，平均粒徑約76 nm，包封率高于95％，4℃下貯存6個(gè)月后，平均粒徑仍在100 urn以下，保留率高于90％。放大試驗(yàn)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)室選定的工藝和配方合理，所得產(chǎn)品性質(zhì)較穩(wěn)定，具有一定的重現(xiàn)性。 在乙醇注入-超聲法制備納米脂質(zhì)體的過(guò)程中，芯材CoQ<,10>的存在有效抑制了脂質(zhì)體體系中丙二醛的生成。在低溫貯存過(guò)程中，CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性與CoQ<,10>的載量相關(guān)，CoQ<,10>的載入不僅顯著抑制了體系中丙

7、二醛的產(chǎn)生，而且有效減緩了脂質(zhì)體平均粒徑的增加。當(dāng)載量高于20％(w/w)時(shí)，CoQ<,10>納米脂質(zhì)體在經(jīng)低溫避光貯存6個(gè)月后，平均粒徑仍在100 nm以下，同時(shí)，保留率在90％以上。CoQ<,10>納米脂質(zhì)體在模擬胃腸液中具有良好的穩(wěn)定性。與CoQ<,10>混懸液相比，以納米脂質(zhì)體作為載體可顯著改善CoQ<,10>的抗脂質(zhì)體過(guò)氧化能力和還原能力。通過(guò)采用熒光探針、拉曼光譜等手段研究了CoQ<,10>與構(gòu)成脂質(zhì)體雙分子層的脂質(zhì)分子的相

8、互作用，探討了CoQ<,10>納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性機(jī)理：納米脂質(zhì)體雙分子層的流動(dòng)性與CoQ<,10>的載量密切相關(guān)。CoQ<,10>的載入顯著提高了脂質(zhì)體雙分子層的微粘度，增強(qiáng)了構(gòu)成脂質(zhì)體雙分子層的脂質(zhì)分子之間排列的橫向有序性，降低了脂質(zhì)體雙分子層的流動(dòng)性，因而保持了貯存過(guò)程中CoQ<,10>納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。 建立了Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)模型。結(jié)果表明，Caco-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)21天培養(yǎng)分化后，在形態(tài)上與小腸上皮細(xì)胞相似，甘露醇

9、通透率小于0.5％/h，跨膜電阻大于600 Ω·cm<'2>，細(xì)胞產(chǎn)生極性分化，符合轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的要求，可以作為研究CoQ<,10>納米脂質(zhì)體小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２捎盟募谆嫉蛩{(lán)(MTT)法研究了納米脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，當(dāng)納米脂質(zhì)體的稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，在37℃下孵育4 h后，Caco-2細(xì)胞存活率高于90％。 CoQ<,10>納米脂質(zhì)體在Caco-2細(xì)胞模型中的攝取研究結(jié)果表明：細(xì)胞對(duì)納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>

10、的攝取量對(duì)時(shí)間未表現(xiàn)出明顯的依賴(lài)性；但細(xì)胞攝取量與CoQ<,10>濃度呈顯著相關(guān)，低濃度時(shí)呈非線性遞增，高濃度下達(dá)到飽和，預(yù)示了CoQ<,10>的攝取過(guò)程中有載體介導(dǎo)參與；也與輔助壁材Tween 80在脂質(zhì)體壁材中所占的比例有關(guān)；在相同的CoQ<,10>濃度水平下，細(xì)胞對(duì)納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>的攝取量與國(guó)外乳狀液產(chǎn)品相比沒(méi)有顯著差異。 CoQ<,10>納米脂質(zhì)體在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)果表明：(1)與CoQ<,

11、10>混懸液以及國(guó)外乳狀液產(chǎn)品相比，采用納米脂質(zhì)體作為CoQ<,10>的輸送系統(tǒng)，顯著促進(jìn)了CoQ<,10>經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，表觀滲透系數(shù)P<,app>增加為(4.19±0.76)×10<'-6>cm/sec，大于一般認(rèn)為腸道吸收良好物質(zhì)的P<,app>(1×10<'-6>cm/sec)：(2)納米脂質(zhì)體中CoQ<,10>經(jīng)Caco-2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制類(lèi)似兼有被動(dòng)擴(kuò)散和載體介導(dǎo)；(3)采用納米脂質(zhì)體輸送CoQ<,10>

12、可降低或掩蓋肽轉(zhuǎn)運(yùn)體以及有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)CoQ<,10>跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)作用，不過(guò)仍然存在P-糖蛋白外排泵參與：(4)CoQ<,10>經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中存在生物還原反應(yīng)，在供給室和接受室中的輔酶Q<,10>均是以原型(氧化型的泛醌CoQ<,10>)存在，Caco-2細(xì)胞中蓄積的輔酶Q<,10>約有75mol％被還原為泛醇(CoQ<,10>H<,2>)。 通過(guò)熒光法從細(xì)胞分子水平研究了納米脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)對(duì)Cac

13、o-2細(xì)胞膜流動(dòng)性和P-糖蛋白的影響。結(jié)果表明，不同稀釋倍數(shù)的納米脂質(zhì)體均能顯著影響Caco-2細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并且其作用與稀釋倍數(shù)具有一定的相關(guān)性。納米脂質(zhì)體中吐溫80的存在能夠顯著抑制P-糖蛋白的外排作用，提高P-糖蛋白作用底物羅丹明-123的細(xì)胞蓄積，該作用與吐溫80的濃度呈正相關(guān)。 大鼠分別以30 mg/kg的劑量灌胃給予CoQ<,10>混懸液(0.5％CMC-Na)、乳狀液(國(guó)外產(chǎn)品)和納米脂質(zhì)體后，T<,max>分別

14、為(2.50±0.58)、(2.00±0.71)和(1.00±0.00)h，C<,max>分別(0.25±0.10)、(0.39±0.14)和(0.44±0.06)μg/mL，AUC<,0～12>h分別為(2.09±0.29)、(2.52±0.66)和(2.76±0.87)μg·mL<'-1>·h。與CoQ<,10>混懸液以及乳狀液相比，以納米脂質(zhì)體作為CoQ<,10>的輸送系統(tǒng)經(jīng)口服具有吸收快的優(yōu)點(diǎn)。以CoQ<,10>的混懸液為對(duì)照，