多肽修飾的脂質(zhì)體靶向腫瘤輸送系統(tǒng)的研究.pdf

1、惡性腫瘤，又稱癌癥，是一類嚴(yán)重危害人類生命的疾病，全球因癌癥死亡的人數(shù)呈逐年增長趨勢。多年來，腫瘤治療一直是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中關(guān)注的焦點，除外科手術(shù)、放射治療之外；藥物治療是主要的治療手段之一。很多具有顯著細(xì)胞毒作用化學(xué)類藥物、放射性藥物被開發(fā)，由于缺乏特異性；隨著血液循環(huán)分布到全身后不僅作用于腫瘤細(xì)胞的也作用于正常細(xì)胞，會引起很大的毒副作用；而日益發(fā)展起來的抗體、小分子抑制劑、基因藥物等，雖然是針對腫瘤相關(guān)的特異性分子、基因發(fā)揮作用，

2、有一定的靶向意義，但是進入體內(nèi)后也分布于全身，只有少量藥物能達(dá)到治療部位發(fā)揮作用，同時可能導(dǎo)致正常組織器官的功能異常。由此可見，腫瘤藥物治療效果的限制，很大程度上在于藥物缺乏分布特異性。為了解決這一瓶頸問題，達(dá)到高效低毒的療效，靶向藥物輸送成為提高療效的一個重要途徑。 脂質(zhì)體作為藥物載體廣泛應(yīng)用于腫瘤藥物輸送中，采用不同種類膜材制備的脂質(zhì)體有不同的藥動學(xué)性質(zhì)，具有不同的藥物釋放特點。膜材含有聚乙二醇(PEG)的脂質(zhì)體，可以逃避網(wǎng)

3、狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲從而延長脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時間，透過腫瘤血管向腫瘤部位濃集，起到被動靶向作用；針對腫瘤相關(guān)受體，將其特異性配體連接在脂質(zhì)體表面，利用配體和受體特異性識別機制引導(dǎo)脂質(zhì)體向靶部位選擇性聚集并釋放藥物，起到主動靶向作用。將這兩方面的靶向特征相結(jié)合的長循環(huán)配體脂質(zhì)體，需要高特異性的配體和穩(wěn)定的脂質(zhì)體系統(tǒng)，以大大增強腫瘤藥物的靶向性。 為了構(gòu)建高效的靶向藥物輸送系統(tǒng)，將腫瘤相關(guān)的特異性表達(dá)或高表達(dá)受體被作為靶標(biāo)，通過細(xì)胞

4、表面受體特異性識別相應(yīng)配體的機制，將配體連接的藥物載體導(dǎo)向腫瘤組織。在受體介導(dǎo)的靶向系統(tǒng)中，作為“彈頭”的配體，除單抗之外，多肽修飾脂質(zhì)體等藥物載體導(dǎo)向腫瘤相關(guān)特異性受體釋藥，具有廣闊的前景。針對特異性受體篩選相應(yīng)的多肽配體，可以采用噬菌體庫展示、序列比對等方法，但是篩選到的一些多肽盡管能特異性結(jié)合受體或受體表達(dá)細(xì)胞，但卻不一定能有效地用于構(gòu)建靶向輸送系統(tǒng)。 鑒于此，本課題中將小分子多肽用來修飾長循環(huán)脂質(zhì)體，并通過體內(nèi)外實驗考察

5、該脂質(zhì)體對特定受體表達(dá)細(xì)胞或腫瘤組織的靶向性，一方面，得到能高特異性靶向受體細(xì)胞或腫瘤組織的多肽配體，建立高效的多肽導(dǎo)向脂質(zhì)體靶向腫瘤輸送系統(tǒng)。另一方面，可以優(yōu)化和建立研究靶向脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)靶向性的體內(nèi)外模型，提供一個有效的多肽配體篩選平臺。 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果總結(jié)如下： 1.制備了性質(zhì)穩(wěn)定的長循環(huán)熒光脂質(zhì)體，以配體插入法將表皮生長因子受體(EGFR)的天然配體EGF修飾脂質(zhì)體構(gòu)建了一個穩(wěn)定的配體脂質(zhì)體系統(tǒng)。根據(jù)激光

6、共聚焦顯微鏡觀察EGF-脂質(zhì)體與高表達(dá)EGFR的細(xì)胞H1299的結(jié)合熒光，調(diào)整、優(yōu)化這個脂質(zhì)體系統(tǒng)的制備方法及其與細(xì)胞共孵育發(fā)生結(jié)合的條件，初步建立了配體脂質(zhì)體特異結(jié)合受體的細(xì)胞模型。在我們的前期工作中，已經(jīng)通過噬菌體展示技術(shù)、親疏水性分析、序列/結(jié)構(gòu)比對分析、計算機虛擬設(shè)計，針對大多數(shù)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的EGFR受體和Tie2受體初步篩選出一些有潛力的候選多肽配體。以EGF修飾的配體脂質(zhì)體作為陽性參照，依據(jù)所建立的配體脂質(zhì)體與細(xì)胞結(jié)合的方

7、法，從中進一步選出能夠介導(dǎo)脂質(zhì)體顯著結(jié)合高表達(dá)EGFR細(xì)胞的多肽D4、GE11。 2.為了更細(xì)致更深入地考察這兩個多肽配體D4、GE11及其導(dǎo)向的脂質(zhì)體系統(tǒng)是否能夠高特異性靶向高表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞，著重將D4、GE11所修飾的熒光脂質(zhì)體或載藥脂質(zhì)體作為研究對象，展開了一系列的體外實驗。通過激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察多肽D4、GE11熒光脂質(zhì)體與不同細(xì)胞的結(jié)合熒光，并以游離EGF或多肽競爭結(jié)合H1299細(xì)胞考察多肽脂質(zhì)體的結(jié)合

8、特異性。結(jié)果表明，與對照脂質(zhì)體相比，多肽脂質(zhì)體除了與U87細(xì)胞發(fā)生強烈的非特異性結(jié)合，與其他表達(dá)EGFR的細(xì)胞均發(fā)生特異性結(jié)合，而且能促進細(xì)胞內(nèi)吞作用。在競爭實驗中，蛋白EGF、多肽D4或GE11明顯能競爭結(jié)合細(xì)胞表面受體，引起對應(yīng)多肽脂質(zhì)體與H1299細(xì)胞結(jié)合減弱，受體的可飽和性充分說明了該脂質(zhì)體與細(xì)胞受體結(jié)合的特異性。采用流式細(xì)胞技術(shù)測定一定數(shù)量的細(xì)胞樣本上特異結(jié)合的脂質(zhì)體熒光強度，進行更準(zhǔn)確的量化分析統(tǒng)計。結(jié)果表明，以非靶向脂質(zhì)體

9、為對照，D4或GE11修飾的脂質(zhì)體在H1299或SPCA1細(xì)胞上特異性結(jié)合并內(nèi)吞引起細(xì)胞熒光強度增大。此外，用D4、GE11來修飾載阿霉素脂質(zhì)體，對照非靶向脂質(zhì)體阿霉素和游離阿霉素，用MTT比色試驗來考察這兩個配體所構(gòu)建的脂質(zhì)體阿霉素靶向高表達(dá)EGFR細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。根據(jù)藥物濃度.細(xì)胞存活率曲線和軟件擬合計算出的藥物半數(shù)抑制濃度，對于H1299和SPCA1兩種細(xì)胞，D4或GE11修飾的脂質(zhì)體阿霉素的細(xì)胞毒性均大于對照脂質(zhì)體阿霉素，更

10、接近于游離阿霉素的細(xì)胞毒性。同時，MTT檢測結(jié)果還表明，當(dāng)多肽或蛋白濃度在1～10ug/ml時，D4、GE11的促細(xì)胞生長刺激作用很小。這些體外實驗結(jié)果表明，多肽D4、GE11能導(dǎo)向脂質(zhì)體特異性結(jié)合細(xì)胞并促進內(nèi)吞，增強載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。 3.與體外細(xì)胞模型相比，體內(nèi)環(huán)境非常復(fù)雜，多肽識別受體并結(jié)合靶細(xì)胞受到多重生理、病理性因素的影響，單憑體外實驗不足以證明所構(gòu)建的配體脂質(zhì)體的可行性。因此，為了進一步探索多肽及其修飾的脂質(zhì)體在

11、體內(nèi)的靶向性，將多肽D4、GE11分別連接于熒光物質(zhì)和熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體上并注射到種有腫瘤的裸鼠體內(nèi)，應(yīng)用eXploreOptixMX(小動物活體光學(xué)分子成像系統(tǒng))觀測裸鼠體內(nèi)的熒光分布情況，對多肽及其修飾的脂質(zhì)體在體內(nèi)的藥動分布代謝進行了詳盡的研究。通過與對照非靶向肽、游離熒光物質(zhì)、非靶向熒光脂質(zhì)體的比較，探討了多肽D4、GE11及其修飾的熒光脂質(zhì)體在接種高表達(dá)受體腫瘤細(xì)胞裸鼠體內(nèi)的靶向性。熒光修飾的多肽D4、GE11，注射入H1299

12、腫瘤裸鼠體內(nèi)之后，較短時間內(nèi)在腫瘤部位有聚集，但很快清除。D4修飾的脂質(zhì)體注入裸鼠體內(nèi)，注射后6小時開始逐漸越來越多地聚集在腫瘤部位，且明顯聚集滯留時間達(dá)到80hr以上。GE11修飾的脂質(zhì)體，從腫瘤局部掃描圖中可以看出，從注射后1小時開始，在腫瘤部位有熒光脂質(zhì)體的聚集。與實驗組相比，對照組聚集在腫瘤部位脂質(zhì)體的熒光強度較弱，且聚集熒光信號很快減弱。這表明，除了普通長循環(huán)脂質(zhì)體在腫瘤部位的EPR效應(yīng)引起被動靶向作用之外，D4和GE11修飾

13、的脂質(zhì)體能主動靶向高表達(dá)EGFR細(xì)胞引起內(nèi)吞并產(chǎn)生延長脂質(zhì)體靶向腫瘤時間的滯留作用。體內(nèi)試驗結(jié)果表明，多肽D4、GE11不僅特異性靶向腫瘤細(xì)胞，而且確實能高效地導(dǎo)向脂質(zhì)體主動靶向腫瘤并產(chǎn)生較長時間的滯留聚集作用。 4.為了模擬腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理特征，建立了人臍內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型。以SPCA1細(xì)胞為陽性參照，通過細(xì)胞免疫熒光實驗檢測共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的Tie2受體表達(dá)，為今后篩選靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的配體多肽提供