磁靶向熱敏脂質(zhì)體為載體的腫瘤診斷體系的研究.pdf

1、臨床上腫瘤的單獨(dú)化療常常會(huì)導(dǎo)致治療效果不佳，探索多機(jī)制治療腫瘤是提高腫瘤治療指數(shù)的有效手段之一。C60具有作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體和射頻（RF）熱治療（RTT）的潛力，本研究將C60衍生化，使其具有磁靶向能力，并使其作為小分子射頻發(fā)熱劑，包裹在熱敏脂質(zhì)體內(nèi)部，通過(guò)射頻照射發(fā)熱控制藥物釋放。其主要內(nèi)容包括：（1）構(gòu)建診療一體化的多功能脂質(zhì)體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；（2）以人源乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）為模型對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；（3）采用鼠源黑色素瘤B

2、16-F10細(xì)胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤模型，對(duì)其體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。
　　為使C60具有磁靶向和腫瘤診斷功能，首先將四氧化三鐵納米粒子（Fe3O4）通過(guò)水熱法化學(xué)鍵合到 C60的表面，并用 PEG2000進(jìn)行修飾，以改善 C60-Fe3O4的水溶性和生物相容性，合成的C60-Fe3O4-PEG2000具有超順磁性和射頻敏感性。然后將 C60-Fe3O4-PEG2000和多西他賽（DTX）抗腫瘤藥包裹在具有葉酸靶頭的熱敏脂質(zhì)體中

3、，形成的載藥系統(tǒng)（DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000）將主動(dòng)靶向和磁靶向相結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物有更高的攝取量，提高了腫瘤治療指數(shù)。
　　DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的制備采用薄膜法，在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方。將制備的 DPPC/ C60-Fe3O4-PEG2000進(jìn)行了表征，其平均粒徑為172.2±1.6nm；透射電鏡（TEM）結(jié)果顯示，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000為類

4、球形；差示掃描量熱（DSC）分析結(jié)果顯示，熱敏脂質(zhì)體的相變溫度42℃；采用超濾離心法和HPLC法測(cè)定載藥系統(tǒng)中DTX的包封率，結(jié)果表明：DTX在脂質(zhì)體中的包封率達(dá)90％；采用透析袋法分別測(cè)定了熱敏脂質(zhì)體在37℃和42℃時(shí)DTX的體外釋放，結(jié)果表明通過(guò)調(diào)節(jié)溫度能較好的控制藥物釋放DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000具有強(qiáng)磁性，MRI實(shí)驗(yàn)表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在磁共振共振T2場(chǎng)成像，具有明顯的濃度

5、依賴性和黑化效應(yīng)。
　　本研究選擇人源乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）作為其體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的模型，考察了DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的細(xì)胞射頻照射毒性及其影響因素，并初步研究了其細(xì)胞毒作用機(jī)制，包括細(xì)胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)、活性氧的測(cè)定、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等。采用 SRB法考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在射頻照射下顯著增強(qiáng)細(xì)胞抑制率，明顯增強(qiáng)細(xì)

6、胞毒性；射頻照射時(shí)間對(duì)細(xì)胞毒產(chǎn)生影響，照射20min時(shí)的抑制率最大。MCF-7攝取實(shí)驗(yàn)中，與C60-Fe3O4-PEG2000相比，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000有更多的細(xì)胞攝入量，表明連有葉酸靶頭的熱敏脂質(zhì)體更有利于包裹藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；利用熒光探針進(jìn)行活性氧檢測(cè)，結(jié)果顯示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在13.56MHz射頻照射下，能夠產(chǎn)生大量的活性氧；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，射頻

7、照射下 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能夠引起更多的腫瘤細(xì)胞凋亡，改變?cè)械募?xì)胞周期，影響了細(xì)胞的有絲分裂，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。
　　采用鼠源黑色素瘤B16-F10細(xì)胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤作為其體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)的模型。DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX的體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)中，考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX分別在射頻和為射頻條件下對(duì)荷瘤小鼠腫瘤的抑

8、制作用，結(jié)果表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在葉酸靶向和磁靶向的載體系統(tǒng)雙重作用下藥物更易于滯留在腫瘤部位，13.56MHz射頻照射后產(chǎn)生熱量，使藥物和 C60-Fe3O4-PEG2000從熱敏脂質(zhì)體中釋放出來(lái)，實(shí)現(xiàn)多機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。DTX在小鼠血漿的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX明顯延長(zhǎng)了DTX在血液中的循環(huán)時(shí)間。藥物在各組織中的分布結(jié)果顯示，具有磁靶向

9、的 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX使藥物更多的聚集在腫瘤部位，該結(jié)果也進(jìn)一步證明構(gòu)建的納米給藥射頻熱療體系在體內(nèi)的磁靶向作用。此外，MRI結(jié)果顯示注射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX后，在外加磁場(chǎng)作用下，小鼠腫瘤部位觀察到明顯的黑化現(xiàn)象，提示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX可作為體內(nèi)磁共振成像T2場(chǎng)的造影劑。
　　體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：DPPC/C60-Fe3O4-P

10、EG2000/DTX可有效的靶向MCF-7細(xì)胞，并高效的穿透細(xì)胞膜，攜帶更多的DTX進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，射頻照射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能高效的產(chǎn)生 ROS，發(fā)揮更強(qiáng)的射頻熱療作用，釋放出藥物和C60-Fe3O4-PEG2000，從而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，最終抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。體內(nèi)的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX具有較低的系統(tǒng)毒性，并延長(zhǎng)DTX在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)

11、間，當(dāng)腫瘤部位外加磁場(chǎng)時(shí)，能將更多的DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX納米粒子滯留在腫瘤部位，射頻照射， C60發(fā)揮其熱療作用，從而控制藥物釋放，通過(guò) C60射頻照射產(chǎn)生活性氧、腫瘤熱損傷和DTX抗腫瘤藥物多機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，最終抑制腫瘤的生長(zhǎng)。另外，注射 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX納米粒子后，使腫瘤部位在磁共振成像中T2場(chǎng)信號(hào)強(qiáng)度大幅度下降，可以將其用作腫瘤磁共振成像診斷的對(duì)比劑。