硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的研究.pdf

1、背景1962年，Beer等從長春花中提取并分離得到了長春堿（vinblastine,VLB）和長春新堿（vincristine,VCR），經(jīng)過不斷探索研究，人們已從長春花中分離得到70多種生物堿，臨床常用的該類藥物有長春堿（VLB）、長春新堿（VCR）以及半合成的長春瑞濱（vinorebine, VRB）和長春地辛(vindesine，VDS)。通過研究發(fā)現(xiàn)，長春新堿在該類藥物中抗腫瘤活性最強，具有很強的微管蛋白結(jié)合能力，同時還能抑制R

2、NA多聚酶活性并干擾蛋白質(zhì)合成，能夠很好抑制腫瘤細(xì)胞增殖。主要用于治療何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病,也用于胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、軟組織肉瘤、支氣管肺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤，此外長春新堿也用于治療血小板減少性紫癜。長春新堿有很強的細(xì)胞毒作用，缺乏選擇性，在臨床應(yīng)用中所導(dǎo)致的消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等藥物不良反應(yīng)（ADR）事件也較為常見，所以臨床常常采用聯(lián)合用藥的方式來降低長春新堿的使用劑量，這是限制其發(fā)揮效應(yīng)的

3、重要因素。
　　脂質(zhì)體（liposome）是以磷脂為主要材料，組成的囊泡狀結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜相似，具有磷脂雙分子層，通過該結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)脂溶性和水溶性藥物包載，借助這一載體能夠?qū)崿F(xiàn)藥物靶向遞送，降低潛在毒性，提升藥物穩(wěn)定性。長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體（Long circulation thermosensitive liposome，LTSL）在普通脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上常使用PEG進(jìn)行修飾（如常用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，DSPE-PE

4、G2000），增大空間位阻，降低了脂質(zhì)體與血漿蛋白的結(jié)合，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的捕捉和吞噬，延長了脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間，同時PEG的引入也能夠防止脂質(zhì)體自身的聚集，提高制劑的穩(wěn)定性。其中，溫度敏感性磷脂的應(yīng)用，使脂質(zhì)體能夠在特定的相變溫度（Tm）將藥物釋放到加熱部位。當(dāng)達(dá)到該溫度時，脂質(zhì)體的磷脂膜由原來緊密的全反式構(gòu)象（膠晶態(tài)）轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷傻耐崤?gòu)象（液晶態(tài)），膜的流動性也隨之大大提高，藥物更容易被釋放出來。通過使用不同的磷脂并調(diào)

5、整所占比例能夠制備得到不同相變溫度的熱敏脂質(zhì)體。研究表明，將少量溶血磷脂（MSPC）引入熱敏脂質(zhì)體能夠進(jìn)一步提高其對溫度的敏感性，加速在相變溫度下的狀態(tài)變化，提升釋藥速度。
　　目的制備長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體，借助腫瘤EPR效應(yīng)提高藥物的靶向性，降低常見毒性反應(yīng)，實現(xiàn)加熱后藥物的快速釋放，提高治療部位藥物濃度。與市售注射用硫酸長春新堿比較，研究其細(xì)胞毒性及體內(nèi)抗腫瘤活性，評價長春新堿熱敏脂質(zhì)體作為實體腫瘤治療的預(yù)期效果及可行性。

6、
　　內(nèi)容采用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體，加壓過膜控制粒徑，pH梯度法主動載藥，制備得到長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體（VCR-TSL，VTSL）。以外觀、粒徑、含量、包封率、熱敏特性、穩(wěn)定性等為主要評價指標(biāo)，篩選最優(yōu)的處方工藝。使用高效液相色譜法建立長春新堿的含量及有關(guān)物質(zhì)分析方法，采用超濾離心法測定脂質(zhì)體包封率。利用透射電子顯微鏡測量并觀察脂質(zhì)體形態(tài)，采用激光粒度分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑。利用穩(wěn)定性分析儀追蹤長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體5個

7、月以上的穩(wěn)定性，同時測定含量、包封率、粒徑等變化。通過MTT法測定體外細(xì)胞毒性，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記（Cou-6）脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用。進(jìn)一步建立裸鼠異種移植腫瘤模型，結(jié)合體外腫瘤部位加熱，對長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的藥效學(xué)及毒性進(jìn)行初步評價。
　　結(jié)果采用DPPC、DSPE-PEG2000、MSPC為磷脂膜材料。通過對水化液，粒徑控制工藝，冷凍保護(hù)劑用量和投料方法等進(jìn)行系統(tǒng)篩選優(yōu)化，確定了以薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體，以

8、0.2M、pH3.0的酒石酸緩沖液為水化液，加壓過膜法控制粒徑以及pH梯度法主動載藥的制備工藝。經(jīng)過處方優(yōu)化，制備得到的脂質(zhì)體平均粒徑在90nm左右；在透射電鏡下觀察，可見脂質(zhì)體的外觀圓整，粒徑大小分布均勻。該工藝制備得到的脂質(zhì)體藥物包封率能夠達(dá)到98％以上；多批樣品制備處方工藝重現(xiàn)性良好。長期試驗表明,脂質(zhì)體在-20℃條件下放置5個月穩(wěn)定性良好。體外細(xì)胞毒性評價說明長春新堿長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體結(jié)合加熱可顯著增強細(xì)胞毒作用，在給藥后72h脂

9、質(zhì)體組中，sw620細(xì)胞活性均小于5%，PANC細(xì)胞活性均小于20%。細(xì)胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)熱敏脂質(zhì)體加熱后更易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,熱敏脂質(zhì)體結(jié)合腫瘤局部加熱，具有良好的腫瘤增值抑制效果，抑瘤率達(dá)到了70%以上，同時，高劑量脂質(zhì)體組裸鼠體重和注射液組無顯著性差異，脂質(zhì)體組裸鼠進(jìn)食情況和活動能力較注射液組優(yōu)，可以初步推斷能夠降低裸鼠全身毒性。
　　結(jié)論本研究制備得到的硫酸長春新堿熱敏脂質(zhì)體具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性