hBAFF靶向載有長春新堿的脂質體殺傷淋巴瘤細胞Raji的實驗研究.pdf

1、淋巴瘤、淋巴細胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液病不僅患病率較高，而且治療困難。迄今為止，用于治療這些疾病的主要方法仍是化學治療，而化療藥物的劑量大小與治療效果直接相關，劑量過小則達不到治療目的，而劑量過大則會產(chǎn)生機體難以耐受的毒副作用。若能使化療藥物靶向聚集于癌組織細胞周圍，則不僅可降低藥物的使用劑量，而且會明顯提高治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，TNF家族的B細胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTN

2、Ffamily，BAFF)的受體不僅在正常B細胞上表達，而且在多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病及非何杰金淋巴瘤等的惡性B細胞上也有較高水平的表達。而BAFF突變體mBAFF-8(217-224八個氨基酸被兩個甘氨酸殘基替換的可溶性BAFF)只能結合BAFF受體，而不能活化淋巴細胞。此突變體在體內(nèi)可競爭與受體的結合，從而阻斷BAFF的生物學活性，抑制淋巴細胞的活化與增殖。因此，mBAFF-8不僅可用作BAFF的競爭抑制劑來治療相關的惡性血

3、液病，而且是一種理想的靶向載體。脂質體作為一種新型藥物載體，能使藥物靶向定位于特定的組織，激活機體自身的免疫功能，減少或降低藥物的毒性。為此，本項目在構建了mBAFF-8cDNA高效表達載體的基礎上，經(jīng)高效表達及純化制備具有受體結合能力但喪失淋巴細胞活化功能的BAFF突變體，超聲分散法制備包載化療藥物的脂質體微粒，然后將mBAFF-8偶聯(lián)到脂質體表面制成靶向脂質體藥物，進而在體外比較所制靶向藥物和非靶向藥物殺傷Raji細胞的效果，最后觀

4、察靶向藥物對荷瘤SCID小鼠的抑瘤作用。所取得的主要研究結果如下： 1.將已構建好的重組原核表達質粒pQE-80L/mBAFF-8轉化大腸桿菌DH5a，采用不同的誘導表達條件誘導目的融合蛋白的表達；經(jīng)Ni2+-NTA層析系統(tǒng)和SepharcrylS200凝膠過濾層析對融合蛋白進行純化；經(jīng)MTT法檢測淋巴細胞的活化情況，鑒定mBAFF-8是否喪失了淋巴細胞活化功能。結果表明最佳表達條件是誘導時間4h，誘導溫度37℃，IPTG終濃度

5、0.2mmoL/L。mBAFF-8占菌體總蛋白的35％，蛋白純度達98％以上，所獲突變蛋白能與淋巴細胞表面受體結合，但不能刺激淋巴細胞增殖。 2.薄膜超聲分散法制備長春新堿脂質體，測得脂質體平均粒徑大約150nm，包封率40％左右。 3.采用SPDP偶聯(lián)法，將mBAFF-8偶聯(lián)到脂質體表面制成靶向脂質體藥物。 4.采用免疫熒光染色實驗鑒定所制靶向脂質體中mBAFF-8與脂質體的偶聯(lián)情況；靶向脂質體與靶細胞結合的免

6、疫熒光染色實驗證明靶向脂質體的靶向作用；以及細胞毒實驗(MTT法)評價體外所制靶向藥物和非靶向藥物殺傷淋巴瘤細胞Raji的效果；結果表明新型偶聯(lián)劑SPDP可使突變體mBAFF-8牢固地結合到脂質體上并且能特異的與靶細胞結合；體外細胞毒實驗結果顯示，長春新堿靶向脂質體對細胞生長的抑制作用有明顯的靶向專一性，對人Raji細胞的體外細胞毒作用優(yōu)于普通脂質體和游離藥物。 5.以Raji細胞尾靜脈注射SCID小鼠，建立了人Raji細胞荷瘤