PLK1基因沉默抑制淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖和侵襲.pdf

1、[目的]Polo樣激酶1(PLK1)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持基因組穩(wěn)定和修復(fù)DNA損傷中起重要作用。研究表明PLK1在人類(lèi)多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞中PLK1表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察RNA干擾PLK1表達(dá)對(duì)淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖、遷移侵襲、細(xì)胞周期和凋亡以及裸鼠移植瘤形成等生物學(xué)行為的影響，研究PLK1在EBV相關(guān)淋巴瘤發(fā)生中的作用，為淋巴瘤的分子機(jī)制研究與靶向治療

2、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]構(gòu)建針對(duì) PLK1基因的慢病毒干擾載體 pLenR-GPH-hPLK1-sh，建立PLK1穩(wěn)定低表達(dá)的Raji細(xì)胞系，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光情況，經(jīng)過(guò)qRT-PCR及Western Blot技術(shù)驗(yàn)證PLK1干擾效果。采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、遷移侵襲實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察PLK1表達(dá)改變前后淋巴瘤Raji細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。
　　[結(jié)果]
　　1.成功建立PLK1穩(wěn)定低表達(dá)的

3、Raji細(xì)胞系。重組質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果與預(yù)期相符，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)顯示，目的基因的干擾質(zhì)粒pLenR-GPH-hPLK1-sh與設(shè)計(jì)的干擾序列吻合率達(dá)100％，證明載體構(gòu)建成功；熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染組攜帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)達(dá)80%；qRT-PCR、Western Blot檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染pLenR-GPH-hPLK1-sh質(zhì)粒的細(xì)胞（干擾組，Raji/PLK1 shRNA）較轉(zhuǎn)染pLenR-GPH的細(xì)胞（空載體組，Raji/GPH

4、）和普通Raji細(xì)胞（空白組）相比，PLK1基因的mRNA表達(dá)及蛋白水平均明顯降低，表明成功建立PLK1穩(wěn)定低表達(dá)的Raji細(xì)胞系。且干擾組PLK1-SH1中PLK1 mRNA水平下降更為明顯，提示干擾效果最好，所以選取PLK1-SH1組進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.干擾PLK1表達(dá)可抑制淋巴瘤 Raji細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力，誘導(dǎo)G2期阻滯和凋亡，并抑制裸鼠移植瘤的形成。
　　CCK-8結(jié)果顯示：干擾組較空載體組及空白組相比，

5、生長(zhǎng)速度慢，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明干擾PLK1表達(dá)可抑制Raji細(xì)胞的增殖。
　　遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾組較空載體組及空白組相比，遷移細(xì)胞數(shù)較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干擾組穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于空載體組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明干擾PLK1的表達(dá)可抑制淋巴瘤Raji細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：干擾組較空載體組及空白組相比，G2期細(xì)胞百分比顯著升高，G1期細(xì)胞百分比降低；細(xì)胞