長(zhǎng)春新堿載體紅細(xì)胞磁化技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 探討應(yīng)用納米級(jí)Fe<,3>O<,4>磁流體(Fe<,3>O<,4> nano-magnetic ferrofluid，MF)與長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)建立及優(yōu)化磁化紅細(xì)胞及磁化VCR載體紅細(xì)胞的制備方法并研究其體外抗腫瘤細(xì)胞作用，探索MF、VCR對(duì)系統(tǒng)血液免疫功能的影響。 方法 用健康成人血及昆明種小鼠血以改良低滲預(yù)膨脹.等滲重封閉法制備磁化紅細(xì)胞及磁化VCR載體紅細(xì)胞，優(yōu)化載體制備條件

2、及觀察方法。檢測(cè)載體紅細(xì)胞生理指標(biāo)、載體細(xì)胞回收率、滲透脆性、貯存穩(wěn)定性，探討磁流體和VCR雙載紅細(xì)胞體外抗腫瘤的生物學(xué)特性。比較靶細(xì)胞K562細(xì)胞增殖、周期和凋亡的變化，驗(yàn)證雙載紅細(xì)胞抗腫瘤活性。利用體外自然實(shí)驗(yàn)體系原理，采用免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析方法，檢測(cè)磁流體和長(zhǎng)春新堿對(duì)血細(xì)胞表面相關(guān)免疫分子表達(dá)的變化規(guī)律。 結(jié)果 磁化紅細(xì)胞及磁化VCR載體紅細(xì)胞載藥參數(shù)良好。磁化VCR載體紅細(xì)胞生物學(xué)特性與VCR載體紅細(xì)胞無(wú)

3、差別，對(duì)K562細(xì)胞都有明顯抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，與未載和磁化紅細(xì)胞有顯著差異。磁流體和VCR共用可明顯提高CD<,4>細(xì)胞陽(yáng)性率(38.87±6.37)％(P<0.01)，而磁流體單用時(shí)白細(xì)胞CD<,55>陽(yáng)性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(68.79±8.98)％明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論 磁化VCR載體紅細(xì)胞載藥參數(shù)良好，殺傷腫瘤細(xì)胞效果明顯?？鼓[瘤藥物載體紅細(xì)胞靶向治療腫瘤具有一定可行性和廣闊應(yīng)用前景，但有關(guān)磁流體品種

4、的優(yōu)選還需進(jìn)一步深入研究。VCR和磁流體對(duì)血細(xì)胞的免疫功能都沒(méi)有不良影響，而且磁流體還可以提高血液免疫反應(yīng)中自細(xì)胞的免疫功能。 一、磁化長(zhǎng)春新堿載體紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究 目的和意義 紅細(xì)胞作為抗癌藥物長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)載體可減少用藥量和提高療效，但其靶向性差。設(shè)想用紅細(xì)胞雙載VCR和納米級(jí)Fe<,3>O<,4>磁流體(Fe<,3>O<,4> nano-magnetic ferroflu

5、id，MF)，借助于外加磁場(chǎng)以解決VCR紅細(xì)胞載體的靶向問(wèn)題。探討磁流體磁化紅細(xì)胞及相關(guān)載體制備最佳實(shí)驗(yàn)條件及分離與鑒定方法，觀察和分析磁化紅細(xì)胞(即單載MF紅細(xì)胞，MF載體紅細(xì)胞)載藥參數(shù)及磁化VCR載體紅細(xì)胞(即雙載VCR及MF紅細(xì)胞，MF+VCR載體紅細(xì)胞)體外相關(guān)生物學(xué)特性，為紅細(xì)胞靶向治療腫瘤提供實(shí)驗(yàn)方法。 方法 磁化紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究1、選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件：通過(guò)對(duì)分散劑的研究解決磁流體凝聚問(wèn)題；建立改良低

6、滲預(yù)膨脹一等滲重封閉法制備MF載體紅細(xì)胞；研究MF濃度與磁響應(yīng)性關(guān)系、RBC與MF的比例、不同低滲液濃度對(duì)結(jié)果的影響、去除血小板與否、超聲與否的比較優(yōu)化載體制備條件。 2、選擇最佳分離條件：比較永磁鐵、脫脂棉、脫脂棉外加磁場(chǎng)、濾紙等幾種分離方法的優(yōu)劣，選擇將未載入紅細(xì)胞的磁流體從反應(yīng)體系中移除的最適方法。 3、選擇合適的鑒定方法：比較涂片技巧、磁化紅細(xì)胞終產(chǎn)物隨外磁場(chǎng)移動(dòng)情況、染色、電鏡觀察等方法，選擇鑒定紅細(xì)胞是否已被

7、磁化的適合檢測(cè)方法。 4、選擇合適的磁流體：比較三種分散性及磁響應(yīng)性不同的磁流體特性，選擇符合磁化紅細(xì)胞條件的磁流體。 5、以自動(dòng)細(xì)胞分析儀測(cè)定全血、洗滌、預(yù)膨脹和載體紅細(xì)胞的數(shù)量、平均容積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCHC)等指標(biāo)，考察載體紅細(xì)胞回收率等載藥參數(shù)及生理特性的變化情況。比較磁化紅細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性。采用滲透脆性檢測(cè)法比較載藥處理各階段對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響。 6、比較昆明種小鼠血與人血磁化方法的

8、區(qū)別以及磁化后載體紅細(xì)胞載藥參數(shù)及生理特性的差別。 結(jié)果 (一)磁化紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究 1、用血漿作分散劑解決磁流體凝聚問(wèn)題；改良低滲預(yù)膨脹-等滲重封閉法制備磁化紅細(xì)胞；提前超聲分散磁流體顆粒、MF濃度為0.5mg/ml、去除血小板影響、選擇肉眼可見溶血之后第二個(gè)濃度低滲液作為膨脹液、RBC與MF比例為2∶1時(shí)是最佳實(shí)驗(yàn)條件。 2、通過(guò)濾紙過(guò)濾分離未包載入紅細(xì)胞的磁流體。 3、通過(guò)質(zhì)控方法的

9、改進(jìn)、觀察實(shí)驗(yàn)終產(chǎn)物隨外磁場(chǎng)移動(dòng)情況、直接涂片、普魯士蘭染色、透射電鏡等方法證明紅細(xì)胞已被磁化。 4、選擇含超順磁性氧化鐵(SPIO)表面是氨基硅烷的磁流體(Fe<,3>O<,4>納米顆粒直徑8～12nm)作為磁化劑。 5、磁化紅細(xì)胞回收率為(67.50±4.55)％，MCV減小(4.00±1.06)％，血紅蛋白含量減少(18.12±3.27)％。單載紅細(xì)胞滲透脆性降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磁化紅細(xì)胞穩(wěn)定貯存可達(dá)5天。

10、 6、昆明種小鼠血磁化實(shí)驗(yàn)條件與人血制備條件基本一致，磁化后載體紅細(xì)胞載藥參數(shù)及生理特性與人血無(wú)顯著差異。 (二)磁化VCR載體紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究： 1、以改良低滲預(yù)膨脹.等滲重封閉法先后包載VCR、MF為制備磁化VCR載體紅細(xì)胞的最佳方法。 2、當(dāng)紅細(xì)胞、VCR、MF三者比例1∶1∶1、提前超聲分散磁流體顆粒、MF濃度為0.5mg/ml、去除血小板影響、選擇肉眼可見溶血之后第二個(gè)濃度低滲液作為膨脹液時(shí)

11、包載效果最好。通過(guò)濾紙過(guò)濾分離未包載入紅細(xì)胞的磁流體。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)終產(chǎn)物隨外磁場(chǎng)移動(dòng)情況、直接涂片、普魯士蘭染色、透射電鏡等方法證明紅細(xì)胞已被磁化。 3、雙載紅細(xì)胞MCV減小(5.204±1.31)％，血紅蛋白含量減少(19.04±3.55)％，載體紅細(xì)胞回收率(69.16±3.15)％，滲透脆性降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磁化VCR載體紅細(xì)胞在PBS中穩(wěn)定貯存可達(dá)5天。雙載紅細(xì)胞MCV、滲透脆性變化、穩(wěn)定貯存時(shí)間與磁化紅細(xì)胞無(wú)明顯差

12、異。 結(jié)論 1、以改良低滲預(yù)膨脹-等滲重封閉法和適合的磁流體品種制備磁化紅細(xì)胞可行，載藥參數(shù)良好，載體紅細(xì)胞生理特性無(wú)明顯改變，為進(jìn)一步探討紅細(xì)胞靶向治療腫瘤提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2、以改良低滲預(yù)膨脹-等滲重封閉法先后包載VCR、MF制備MF+VCR載體紅細(xì)胞可行，實(shí)驗(yàn)條件與單載MF紅細(xì)胞制備條件基本一致，紅細(xì)胞、VCR、MF三者比例1∶1∶1時(shí)是最佳濃度配比。雙載紅細(xì)胞與磁化紅細(xì)胞回收率及生理特性無(wú)明顯改變，紅

13、細(xì)胞能夠作為抗癌藥靶向治療腫瘤的載體。 二、磁化VCR載體紅細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)研究 目的和意義 比較磁化VCR載體紅細(xì)胞、VCR單載紅細(xì)胞與單獨(dú)使用VCR對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用以及在外加磁場(chǎng)條件下磁化VCR載體紅細(xì)胞對(duì)抗腫瘤的作用，探討磁化VCR載體紅細(xì)胞體外抗腫瘤效果，為紅細(xì)胞作為靶向藥物載體的抗腫瘤治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 采用改良低滲預(yù)膨脹.等滲重封閉法制備載體紅細(xì)胞。比較MF+V

14、CR載體紅細(xì)胞、MF載體紅細(xì)胞、VCR載體紅細(xì)胞、未載藥紅細(xì)胞、MF+VCR工作液、VCR工作液、MF工作液、空白對(duì)照、MF+VCR載體紅細(xì)胞加弱磁場(chǎng)組(0.3T)、MF+VCR載體紅細(xì)胞加強(qiáng)磁場(chǎng)組(1.8T)、MF載體紅細(xì)胞加弱磁場(chǎng)組(0.3T)、MF載體紅細(xì)胞加強(qiáng)磁場(chǎng)組(1.8T)、MF+VCR工作液加磁場(chǎng)組(0.9T)、VCR工作液加磁場(chǎng)組(0.9T)、MF工作液加磁場(chǎng)組(0.9T)、空白對(duì)照加磁場(chǎng)組(0.9T)等十六組的抗癌效果

15、。采用載體紅細(xì)胞與K562細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，MTF法檢測(cè)K562細(xì)胞的增殖情況，PI染色流式細(xì)胞儀分析K562細(xì)胞周期，Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀分析K562細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)論 磁化VCR載體紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞具有明顯增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，在外加磁場(chǎng)條件下抗腫瘤作用增強(qiáng)。K562細(xì)胞周期分析結(jié)果符合VCR的抗腫瘤作用機(jī)制。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證明，與未載紅細(xì)胞和磁化紅細(xì)胞相比，雙載紅細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞

16、作用更強(qiáng)。 三、磁流體與長(zhǎng)春新堿對(duì)系統(tǒng)血液免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的和意義 探討磁流體對(duì)機(jī)體生理功能的影響，特別是對(duì)免疫功能是否有負(fù)面影響。利用現(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)理論與方法研究磁流體和VCR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)系統(tǒng)血液免疫功能是否有正負(fù)影響，為VCR載體紅細(xì)胞磁化研究提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法 在體外利用自然實(shí)驗(yàn)體系原理，采用免疫熒光標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析方法，研究納米級(jí)Fe<,3>O<,4>磁流體(MF)和抗癌

17、藥物長(zhǎng)春新堿(VCR)對(duì)系統(tǒng)血液免疫功能的影響進(jìn)行分子水平的探討，檢測(cè)兩者對(duì)血細(xì)胞表面相關(guān)免疫分子(CD<,4>、CD<,8>、CD<,55>、CD<,59>等)表達(dá)影響的變化規(guī)律。 結(jié)論 VCR(0.2mg/ml)和納米級(jí)Fe<,3>O<,4>磁流體對(duì)血細(xì)胞的免疫功能都沒(méi)有不良影響，甚至磁流體還可以調(diào)控和改善血液免疫反應(yīng)中白細(xì)胞的免疫功能，為紅細(xì)胞包載磁流體和抗癌藥物治療腫瘤提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為抗癌藥紅細(xì)胞載體靶向抗