環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細(xì)胞間隙連接蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　環(huán)磷酰胺及長春新堿因抗腫瘤效果良好,是臨床上常用的化療藥物,而化療藥物常對生殖細(xì)胞有毒副作用。
　　環(huán)境中的有毒物質(zhì)或其體內(nèi)代謝產(chǎn)生的有害毒物要作用于生精細(xì)胞,必需要先通過血睪屏障,而在與生精細(xì)胞接觸前,需先要經(jīng)過睪丸支持細(xì)胞,或者是通過影響支持細(xì)胞的功能而進(jìn)一步對生殖細(xì)胞發(fā)揮作用。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),支持細(xì)胞是多種有毒物質(zhì)作用的靶細(xì)胞,進(jìn)而影響生殖細(xì)胞。
　　目前已有較多實(shí)驗(yàn)證實(shí)對生殖細(xì)胞的有害物質(zhì)能減少

2、支持細(xì)胞的連接蛋白,使支持細(xì)胞上的間隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)的表達(dá)數(shù)量減少,從而影響細(xì)胞間縫隙連接通訊的功能,進(jìn)一步影響到睪丸支持細(xì)胞對精子發(fā)生的正常功能,致使生殖細(xì)胞功能及發(fā)育異常。因此,我們推測長春新堿、環(huán)磷酰胺影響睪丸支持細(xì)胞CX43的表達(dá)是其雄性生殖毒副作用的可能機(jī)制之一。
　　本研究以不同濃度環(huán)磷酰胺及長春新堿加入小鼠睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn),并采用不同方法檢測支持細(xì)胞胞間Cx43表達(dá)情況

3、,了解環(huán)磷酰胺及長春新堿是否減少睪丸支持細(xì)胞表達(dá)CX43蛋白,評估兩種藥物是否對睪丸支持細(xì)胞的間隙連接通訊功能產(chǎn)生影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　小鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng),分別用不同濃度環(huán)磷酰胺、長春新堿加入細(xì)胞行培養(yǎng),用MTT法檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性,確定環(huán)磷酰胺及長春新堿實(shí)驗(yàn)藥物濃度。選取環(huán)磷酰胺長春新堿實(shí)驗(yàn)藥物濃度分別作用支持細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)結(jié)果行RT-PCR分析。同理,選取環(huán)磷酰胺長春新堿最佳藥物濃度分

4、別作用支持細(xì)胞培養(yǎng),行免疫熒光染色檢測培養(yǎng)的支持細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果提示,隨著藥物劑量的加大,支持細(xì)胞的存活率進(jìn)行性下降,為避免細(xì)胞過多死亡影響Cx43的表達(dá),確定環(huán)磷酰胺4ug/ml、長春新堿40ug/L為實(shí)驗(yàn)藥物濃度。RT-PCR分析結(jié)果顯示,經(jīng)培養(yǎng)后,內(nèi)參GAPDHmRNA在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)無明顯變化,而環(huán)磷酰胺、長春新堿作用6h,12h,24h,48h后,Cx43mRNA隨時(shí)間延長表

5、達(dá)逐步下降,且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用明顯,說明環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細(xì)胞表達(dá)CX43有明顯抑制作用。免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示,代表CX43的綠色熒光斑,正常對照組光斑密度大,而環(huán)磷酰胺及長春新堿作用后光斑密度明顯減少,并且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用明顯。
　　結(jié)論：
　　環(huán)磷酰胺及長春新堿能減少睪丸支持細(xì)胞的CX43蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制間隙連接通訊功能,且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用更明顯。環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細(xì)胞有毒性,