沉默survivin基因增強(qiáng)KB和KBv200對(duì)長春新堿敏感性的研究.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多化療藥物殺傷腫瘤的重要方式，凋亡抗性可導(dǎo)致腫瘤耐藥的產(chǎn)生。survivin是最近發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的重要因子，可與活化的caspase-3、7和9結(jié)合并抑制其活性，使凋亡通路活化受阻，也降低了化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用，與腫瘤耐藥密切相關(guān)。研究表明，survivin在MDR株往往表達(dá)增高，可以對(duì)抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用，提示survivin在耐藥機(jī)制中具有重要作用。我們的研究顯示，survivin在口腔癌細(xì)胞KB和耐藥

2、株KBv200均有表達(dá)，且以KBv200表達(dá)較高，提示可能與口腔癌的耐藥機(jī)制有關(guān)。因此，我們擬通過RNA干擾方法沉默survivin基因，觀察對(duì)口腔癌細(xì)胞KB和耐藥株KBv200的凋亡影響，檢測兩細(xì)胞株化療敏感性的改變，以尋找提高化療敏感性的新方法。 1.方法參考LipofectamineTM2000說明書，以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。熒光顯微鏡下觀測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法檢測細(xì)胞中survivinmRNA和mdr1mR

3、NA水平，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記二抗法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中survivin蛋白水平，Hoechst33258熒光染色法觀測細(xì)胞形態(tài)，PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀法檢測細(xì)胞凋亡率，DiOC6染色結(jié)合流式細(xì)胞儀法檢測線粒體膜電位，caspase-3和caspase-9活性測定試劑盒檢測caspase-3和caspase-9的活性，MTT法測定腫瘤細(xì)胞生長情況和化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，ChouTCandTalalay藥物量效公式分析干擾質(zhì)粒與長春新

4、堿對(duì)細(xì)胞的聯(lián)合作用，羅丹明123排出實(shí)驗(yàn)檢測P-gp的泵功能。 2.結(jié)果2.1以siRNA方法沉默survivin對(duì)KB和KBv200凋亡和生長的影響mu6/survivin質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染KB和KBv200細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率分別為(69±5)％和(71±4)％。RT-PCR產(chǎn)物和流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示，survivin在KB和KBv200中均有表達(dá)，且以KBv200細(xì)胞中表達(dá)量較高。轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后48h，surv

5、ivinmRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降。KB和KBv200細(xì)胞中survivinmRNA表達(dá)抑制率分別為(62±8)％和(59±6)％，蛋白表達(dá)抑制率分別為(44±5)％和(39±4)％。 轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后24h、48h、72h，KB和KBv200細(xì)胞凋亡都明顯增加，均在48h凋亡達(dá)到高峰，說明沉默survivin不僅能夠促進(jìn)KB凋亡，而且也能夠促進(jìn)KBv200凋亡。同時(shí)，KB和KBv200細(xì)胞的生長也被抑制。轉(zhuǎn)

6、染mu6/survivin質(zhì)粒后24h、48h、72h，KB細(xì)胞生長抑制率分別為(33±2)％、(58±3)％和(60±5)％，KBv200細(xì)胞生長抑制率則分別為(35±3)％、(45±4)％和(44±4)％。 2.2沉默survivin對(duì)KB和KBv200細(xì)胞化療敏感性的影響KB和KBv200對(duì)長春新堿的IC50分別為(0.021±0.002)μM和(1.094±0.127)μM。沉默survivin后，KB對(duì)VCR的IC50

7、降至(0.005±0.029)μM，KBv200對(duì)VCR的IC50降至(0.134±0.107)μM，說明沉默survivin基因增強(qiáng)了長春新堿介導(dǎo)對(duì)兩細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用，不僅能使敏感株KB增敏，而且能使耐藥株KBv200恢復(fù)對(duì)長春新堿的敏感性。ChouTCandTalalay藥物量效公式分析干擾質(zhì)粒與長春新堿對(duì)細(xì)胞株的聯(lián)合作用，結(jié)果表明，與單獨(dú)應(yīng)用VCR相比，干擾質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用VCR對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)。mu6/survivin

8、質(zhì)粒與VCR的聯(lián)合化療指數(shù)CI均小于1，表明兩者合用呈協(xié)同效應(yīng)，對(duì)腫瘤的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用效果好。 2.3沉默survivin對(duì)凋亡途徑的影響轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后，兩株細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性均增加，在48h達(dá)到高峰，證明沉默survivin的確能夠有效激活caspase-3和caspase-9；兩株細(xì)胞線粒體膜電位均降低，在48h達(dá)到最低，提示線粒體內(nèi)源性凋亡途徑可能參與沉默survivin

9、介導(dǎo)的凋亡。這些結(jié)果表明沉默survivin可以活化凋亡途徑，有助于提高化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用。 2.4沉默survivin不影響P-gp表達(dá)及功能分別沉默survivin與mdr1基因均未影響另一種基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。沉默mdr1基因能夠有效抑制KBv200細(xì)胞中P-gp的泵功能，但是沉默survivin基因?qū)-gp的泵功能沒有影響。沉默survivin后，F(xiàn)G020326作為P-gp的抑制劑，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)KBv200對(duì)長

10、春新堿的化療敏感性，但對(duì)缺乏P-gp表達(dá)的KB細(xì)胞株，卻幾乎沒有增敏作用。說明沉默survivin增強(qiáng)KBv200的化療敏感性，但是不涉及P-gp的表達(dá)改變和功能。沉默mdr1和survivin基因均能夠增強(qiáng)caspase-3活性，同時(shí)抑制兩者的表達(dá)，caspase-3活性被激活得更為明顯，提示聯(lián)合沉默survivin與mdr1基因可能更有利于活化凋亡通路。 3.結(jié)論1.RNA干擾方法可以有效沉默口腔癌細(xì)胞KB和KBv200中的

11、survivin基因。 2.沉默survivin不僅能夠促進(jìn)口腔癌細(xì)胞親本株KB凋亡，而且能夠促進(jìn)耐藥株KBv200細(xì)胞凋亡，并抑制兩種細(xì)胞的生長。 3.沉默survivin可以增強(qiáng)長春新堿介導(dǎo)對(duì)KB和KBv200的細(xì)胞毒作用，不但能使敏感株KB增敏，而且能提高耐藥株KBv200對(duì)長春新堿的敏感性。 4.聯(lián)合應(yīng)用survivinshRNA質(zhì)粒與長春新堿對(duì)口腔癌細(xì)胞株KB和KBv200具有協(xié)同殺傷效應(yīng)。 5