三氧化二砷和長春新堿誘導骨肉瘤細胞株凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是常見的骨骼原發(fā)性惡性腫瘤,其好發(fā)于青少年,且易早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移,5年生存率低,是嚴重影響青少年身心健康的惡性疾病。盡管在早期手術及輔助化療可以明顯改善患者的預后,但仍為目前死亡率和致殘率較高的惡性疾病。而對于遠處轉(zhuǎn)移的患者化療為唯一有效的方法。目前可供臨床選用化療藥物有限,也普遍存在耐藥的問題,因此,研制、篩選毒副作用小,療效高的抗癌藥物,已成為當前十分重要的領域。三氧化二砷(ars

2、enic trioxide,As2O3)已經(jīng)應用于治療復發(fā)性急性早幼粒細胞白血病(APL,M3),且療效顯著。但對于三氧化二砷治療骨肉瘤的研究較少。長春新堿(vincristine,VCR)已經(jīng)應用于治療骨肉瘤,但其具體治療分子機制研究尚少。本實驗主要研究三氧化二砷及長春新堿誘導體外骨肉瘤細胞株MG-63凋亡及其誘導細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的分子機制,為以后臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:將MG-63細胞置于37℃,飽和濕

3、度5％CO2的10％DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。
　　 1光鏡觀察:將不同濃度的三氧化二砷和長春新堿作用于MG-63細胞,在倒置相差顯微鏡下定時觀察細胞的生長情況并照相。
　　 2 MTT法:調(diào)整細胞濃度為1×105/ml,以每孔100ul培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中,待細胞進入對數(shù)生長期后,用不同濃度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)和長春新堿(4、2、1、0.5μg/ml)作用不同時間(

4、24h、36h、48h、60h),采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測藥物對細胞的生長抑制作用。
　　 3流式細胞術:不同濃度三氧化二砷和長春新堿作用36h;對照組(不含藥),8μmol/L三氧化二砷作用分別24h、36h、48h和60h,2μg/ml長春新堿作用作用12h、24h、36h和48h,收集細胞。收集細胞數(shù)為(1～5)×106個,胰酶消化后用1％小牛血清終止,500～1000r/min離心5min,棄去上清,3ml P

5、BS洗一次,加入冰預冷的70％的乙醇固定,4℃,1h。離心棄去固定液,PBS洗一次,加入碘化丙錠(Propidium Iodide,PI:50mg/LTrinton X-1001.0％)4℃避光染色30min,用Epics-XLⅡ型流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期分布,應用軟件進行分析。
　　 4 Western印跡法觀察三氧化二砷及長春新堿作用于人成骨肉瘤細胞MG-63后PCNA、Caspase-3、CyclinDl、Cycl

6、inE、Bcl-2、Bax的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1倒置相差顯微鏡下觀察可見經(jīng)三氧化二砷及長春新堿作用MG-63細胞后,細胞隨時間的延長,隨濃度的增加,開始細胞形狀由梭形變?yōu)閳A形,但細胞膜完整,然后細胞開始皺縮,圓形細胞逐漸增多,細胞貼壁能力減弱,漂浮。隨后細胞體積普遍變小,胞質(zhì)濃縮,細胞形態(tài)不規(guī)則,胞膜不完整,貼壁細胞少見,最后大部分細胞漂浮,變化更加明顯,基本無貼壁細胞。
　　 2不同濃度三氧化二砷(1

7、0、8、6、4μmol/L)和不同濃度長春新堿(4、2、1、0.5μg/m1)作用MG-63細胞24h、36h、48h、60h,MTT結(jié)果顯示三氧化二砷和長春新堿均能明顯抑制MG-63細胞增殖,并呈劑量和時間依賴性(p＜0.05)。
　　 3 FCM分析發(fā)現(xiàn),不同濃度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)處理細胞36h及8μmol/L三氧化二砷處理細胞24h、36h、48h、60h,G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰,S期細胞所占比

8、例隨藥物濃度和時間增加呈上升趨勢,所占比例最高達81.4％,而G1期所占比例明顯減少。不同濃度長春新堿(4、2、1、0.5μg/m1)處理細胞36h及2μg/ml長春新堿處理細胞12h、24h、36h、48h后,G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰,G2/M期所占比例隨藥物濃度和時間增加呈上升趨勢,最大所占比例為92.5％,而G1期所占比例明顯減少。
　　 4 western-blotting結(jié)果:經(jīng)三氧化二砷和長春新堿處理過的骨肉瘤細胞

9、與對照組相比均表現(xiàn)出PCNA、CyclinD1、CyclinE和Bcl-2蛋白表達抑制,Bax及Caspase-3蛋白表達增強。
　　 結(jié)論:
　　 1三氧化二砷和長春新堿均有誘導骨肉瘤細胞MG-63凋亡和抑制增殖的作用,且具有時間.劑量依賴關系。隨時間延長不同濃度藥物對細胞的最終抑制作用一致。低濃度藥物作用長時間和高濃度藥物作用短時間對細胞抑制作用一致。提示凋亡峰最高時的濃度可能是最適濃度。
　　 2長春新堿對

10、骨肉瘤細胞MG-63顯示出明顯G2/M期阻滯作用,并可誘導其凋亡,且有一定的時間-劑量依賴性。三氧化二砷在細胞增殖周期中將細胞阻滯于S期細胞,從而干擾細胞DNA或蛋白質(zhì)的合成。
　　 3.As2O3及VCR作用于骨肉瘤細胞MG-63后通過抑制Bcl-2蛋白表達而增強Bax及Caspase-3蛋白表達來誘導細胞凋亡。通過抑制CyclinD1及CyclinE蛋白表達來抑制細胞增殖。
　　 4三氧化二砷可與長春新堿聯(lián)合應用治療