骨肉瘤患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)及Oridonin-Grifolin誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分 骨肉瘤患者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究 近二十年來(lái)實(shí)施的手術(shù)聯(lián)合大劑量化療，使骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)手術(shù)后五年生存率提高到60-70﹪，但許多患者在確診時(shí)或病程中已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，給治療帶來(lái)很大困難。長(zhǎng)期的診斷與治療研究顯示，找到骨肉瘤特異性生物標(biāo)記物是早期診斷和提高療效的新途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)在尋找生物標(biāo)記物方面具有高通量，高效率。2-D DIGE是近年來(lái)發(fā)展的新蛋白質(zhì)組技術(shù)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)的

2、建立，大大減少了人為因素影響，可信度大幅提高。骨肉瘤患者血清2-D DIGE技術(shù)尚未建立，應(yīng)用該技術(shù)尋找骨肉瘤患者血清中表達(dá)差異蛋白質(zhì)的研究，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)OS患者血清進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，尋找患者血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并與以往對(duì)OS的基因研究資料相結(jié)合，不僅有助于從分子水平認(rèn)識(shí)OS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也可以為OS的篩選和診斷提供有效的分子標(biāo)記物，并有望為OS的防治提供新的分子靶點(diǎn)。 目的: 1．建立骨肉瘤患者血清雙

3、向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，為利用該技術(shù)研究骨肉瘤患者血清蛋白組變化奠定基礎(chǔ)。 2．建立OS的蛋白質(zhì)指紋(PMF)。 3．尋找骨肉瘤患者血清中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，探討這些蛋白在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為骨肉瘤的早期診斷和篩選提供潛在的分子標(biāo)記物。 4．應(yīng)用Western blot和ELISA方法，驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定結(jié)果的真實(shí)性、可靠性。 方法: 1．收集骨肉瘤患者和正常成人血清樣本各4例，血清經(jīng)PROT-

4、BA Kit試劑盒處理后，分別進(jìn)行不同的CyDye染料交叉標(biāo)記，然后依次進(jìn)行雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳、圖像掃描，并用專用分析軟件DeCyderv6.0，比較各組樣本間蛋白點(diǎn)圖像差異，并評(píng)估該技術(shù)體系。 2．提取32例骨肉瘤患者及30例正常成人血清蛋白，用不同的CyDye染料交叉標(biāo)記后，依次進(jìn)行雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳以分離蛋白質(zhì)、圖像分析以尋找表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，對(duì)表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖譜

5、，檢索MASCOT、數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白。 3．用Western Blot和ELISA方法，對(duì)明顯的差異蛋白驗(yàn)證。 結(jié)論： 1．成功建立了骨肉瘤患者血清雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，為研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供了一種有效手段。 2．2-D DIGE分析結(jié)果進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，PMF法成功鑒定出43個(gè)蛋白質(zhì)，從中篩選出屬于差異性蛋白質(zhì)43種。質(zhì)譜鑒定出43個(gè)骨肉瘤相關(guān)血清蛋白質(zhì)，18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，25個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下

6、調(diào)，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 3．比較骨肉瘤和正常人血清蛋白質(zhì)2-D DIGE圖譜，初步確定了2個(gè)骨肉瘤上調(diào)血清蛋白點(diǎn)(SAA、CP)和1個(gè)骨肉瘤下調(diào)蛋白點(diǎn)(Gelsolin)與骨肉瘤發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)。SAA的血清含量在骨肉瘤患者化療前、后、術(shù)后以及復(fù)發(fā)等同治療階段均有變化。 第二部分 Grifolin/Oridonin誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制 化療是治療骨肉瘤的三大手段之一，但目前傳統(tǒng)的化療藥物主要是細(xì)胞

7、毒藥物，不可避免地會(huì)影響正常細(xì)胞，帶來(lái)臨床上常見(jiàn)的各種不良反應(yīng)。另一方面耐藥性的產(chǎn)生也限制了這類藥物在臨床上的應(yīng)用。從天然物質(zhì)(尤其是中藥)中尋找毒副作用小、安全有效的抗腫瘤藥物成為近年的研究熱點(diǎn)。針對(duì)促凋亡作用和特定靶點(diǎn)的藥物研究是腫瘤化療藥物開(kāi)發(fā)的主要方向之一。近幾年來(lái)，天然中草藥的抗癌作用靶點(diǎn)的研究成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)的熱門。尋找靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研究具有廣闊的前景，但國(guó)外已開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)(如Akt)特異性抗腫瘤候選化合物大多穩(wěn)定性

8、差，細(xì)胞通透性和溶解度不佳，目前仍處于臨床前期的研究。而本課題組在用體外生化檢測(cè)法篩選天然產(chǎn)物及其衍生物時(shí)發(fā)現(xiàn)，Grifolin(奇果菌素)和Oridonin(冬凌草甲素)在體外能明顯抑制Akt激酶的活性。Grifolin是從奇果菌分離出的多糖，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、殺菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用。Oridonin是冬凌草的主要有效成分，是從冬凌草中提取出來(lái)的一種以貝殼杉烯(ent-kaurene)為骨架的四環(huán)二萜類化合物，大量資料證明

9、它對(duì)多種腫瘤均具有明顯的抑制作用，其對(duì)實(shí)體瘤如食道癌、肝癌等的治療已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了明顯的療效。 目的: 本研究分別探討Grifolin和Oridonin對(duì)兩種骨肉瘤細(xì)胞(U20S和MG63細(xì)胞)凋亡及其作用機(jī)制，以及對(duì)Akt活性抑制作用，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)對(duì)Akt磷酸化的影響和Akt下游靶分子的影響研究，為這些藥物的研究、開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1．MTT法測(cè)定Grifolin和O

10、ridonin對(duì)細(xì)胞存活率的影響。 2．Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)，分別檢測(cè)Grifolin和Oridonin處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和DNA含量的變化，線粒體膜電位變化，對(duì)細(xì)胞色素C的釋放影響。 3．采用Western Blot檢測(cè)，分析相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平變化。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，用SPSS 14.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分

11、析。 結(jié)論： 1、Grifolin和Oridonin均能抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG63增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 2、通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，Grifolin和Oridonin能在體外抑制Akt的活性。Grifolin和Oridonin在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)抑制Akt的活性及其下游信號(hào)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 3、Oridonin有可能影響MAPKs通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 4、Grifolin和Oridonin