紫杉醇脂質(zhì)體與依托泊苷對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討紫杉醇脂質(zhì)體（paclitaxelliposome）與依托泊苷(etoposideVP-16)對(duì)入骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的細(xì)胞毒性及其分子機(jī)制的對(duì)比研究，為紫杉醇脂質(zhì)體、依托泊苷治療骨肉瘤的合理性選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：將MG-63細(xì)胞置于37℃、5％CO2飽和濕度的常規(guī)條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1藥物的配制：將紫杉醇脂質(zhì)體用10ml5％葡萄糖注射液稀釋，震蕩器振搖Smin充

2、分混勻后制備成3mg/ml的儲(chǔ)備液，依托泊苷制備成0.02g/ml的儲(chǔ)備液，4℃避光保存。使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。
　　 2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將不同濃度的紫杉醇脂質(zhì)體和依托泊苷分別作用于MG-63細(xì)胞24h、48h、72h，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并照相。
　　 3MTT試驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/m1，每孔200μ1接種于96孔板，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)不同濃度紫杉

3、醇脂質(zhì)體(0.1、1、10、100ng/ml)和依托泊苷(6.25、12.5、25、50、10011g/ml)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：采用不同濃度的紫杉醇脂質(zhì)體與不同濃度的依托泊菅，藥物作用48h，收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，加入1ml冷PBS洗滌二次，分別加入FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)和碘化丙啶（操作按說明書進(jìn)行），避光室溫反應(yīng)15min，用Epi

4、c-XLⅣ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡.
　　 5Western印跡法：觀察IC50的紫杉醇脂質(zhì)體及IC50的依托泊苷作用人成骨肉瘤細(xì)胞MG-6348h后的PCNA、cyclinDl、cyclinE、Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)倒置顯微鏡下觀察，將紫杉醇脂質(zhì)體按不同濃度(0.1、1、10、100ng/ml)作用于MG-63細(xì)胞48h后，可見細(xì)胞從梭形慢慢變成圓形，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)聚集，細(xì)胞與細(xì)胞間距增大，隨

5、著藥物濃度的增加，胞漿內(nèi)顆粒也隨之增多，細(xì)胞與平皿的附著力減弱，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞漂浮。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)正常，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好。不同濃度的依托泊苷作用于MG-63細(xì)胞48h后，觀察可出現(xiàn)明顯的受抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用也隨之更加明顯，隨著藥物濃度的增加，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多。最低濃度的依托泊苷作用48h，仍可見少量細(xì)胞的形狀有變化，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，部分細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)基中，貼壁

6、的細(xì)胞中可見少數(shù)膜破裂壞死。
　　 2MTT結(jié)果：不同濃度(0.1、1、10、100ng/ml)紫杉醇脂質(zhì)體和不同濃度(6.25、12.5、25、50、100ug/ml)依托泊苷分別作用于MG-63細(xì)胞24h、48h、72h，MTT結(jié)果顯示紫杉醇脂質(zhì)體和依托泊苷均能明顯抑制MG-63細(xì)胞增殖，并呈劑量-時(shí)間依賴性(P＜0.05)。
　　 3流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果：經(jīng)不同濃度的紫杉醇脂質(zhì)體和各濃度的依托泊苷分別處理MG-63

7、細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率分別是(5.2±0.42)％、(7.3±0.14)％、(18.15±0.21)％、(30.2±0.38)％和(5.2±0.28)％、(7.8±0.41)％、(21.8±0.26)％、(32.3±0.45)％、(43.2±0.13)％與對(duì)照組相比較，有顯著性差異。由此可見紫杉醇脂質(zhì)體和依托泊泊苷都可使MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且隨著藥物濃度的增加，凋亡率也隨之增加。
　　 4Western-bloting結(jié)