米托蒽醌葉酸靶向脂質(zhì)體的研究.pdf

1、脂質(zhì)體可以提高藥物的穩(wěn)定性，降低毒副作用，并可以通過增強(qiáng)滲透與滯留（Enhanced Permeation and Retention，EPR）效應(yīng)使裝載抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體在腫瘤組織富集以提高藥物在腫瘤組織的被動(dòng)靶向性。當(dāng)脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤組織后將包裹的藥物釋放到腫瘤間質(zhì)，以游離藥的形式進(jìn)入到腫瘤區(qū)細(xì)胞中，這一過程相對比較緩慢，并且不能有效的進(jìn)入到多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建葉酸（Folic Acid，F(xiàn)A）修飾的聚乙二醇（PEG）化磷脂主動(dòng)

2、靶向脂質(zhì)體，可以改變脂質(zhì)體的向腫瘤細(xì)胞遞送藥物的方式。由于，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的葉酸受體，進(jìn)入腫瘤區(qū)的表面修飾葉酸的脂質(zhì)體可以與其特異性結(jié)合，將完整的脂質(zhì)體內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，之后，富集到細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體再釋放出游離藥殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　目的：
　　本研究制備葉酸靶向脂質(zhì)體，通過改變藥物的遞送途徑，增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的富集并實(shí)現(xiàn)有效釋放，從而提高藥物的治療指數(shù)。同時(shí)，進(jìn)行克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的研究，為腫瘤多藥耐藥治療提供依據(jù)

3、。
　　方法：
　　采用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)葉酸受體蛋白的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測葉酸受體基因mRNA的表達(dá)，從而篩選出高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　確定葉酸靶向脂質(zhì)體的制備方法：首先制備以硫酸銨溶液為內(nèi)相的空白脂質(zhì)體，通過葡聚糖凝膠Sephadex G-75柱透析置換空白脂質(zhì)體外相，形成硫酸銨梯度，將藥物與透析后的空白脂質(zhì)體孵育一定時(shí)間即得脂質(zhì)體混懸液。
　　進(jìn)行葉酸靶

4、向脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取試驗(yàn)，以阿霉素為藥物，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，考察不同 DSPE-mPEG2000含量、葉酸輔料類型、葉酸輔料含量、脂質(zhì)體粒度等因素對腫瘤細(xì)胞攝取率的影響，從而篩選出優(yōu)化的處方。
　　以優(yōu)化的處方制備米托蒽醌葉酸靶向脂質(zhì)體，進(jìn)行制劑學(xué)性質(zhì)研究，主要包括外觀、pH值、粒度、滲透壓、包封率、含量和釋放率等指標(biāo)的測定，并進(jìn)行2個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
　　采用MCF-7人乳腺癌細(xì)胞和MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞對米托蒽醌游

5、離藥、米托蒽醌無葉酸脂質(zhì)體（MIT-L）、米托蒽醌葉酸靶向脂質(zhì)體（MIT-FL）進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn)及細(xì)胞抑制（MTT）試驗(yàn)，考察葉酸靶向脂質(zhì)體克服多藥耐藥性情況。
　　進(jìn)行高表達(dá)和低表達(dá)葉酸α受體的腫瘤細(xì)胞和表達(dá)葉酸β受體的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，以考察葉酸靶向脂質(zhì)體在葉酸表達(dá)程度不同的細(xì)胞中的富集量差異，以及進(jìn)入細(xì)胞的脂質(zhì)體能否有效的起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
　　以NOD-SCID雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立人 K

6、B口腔表皮樣癌移植瘤腫瘤模型，進(jìn)行米托蒽醌葉酸靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)研究，考察小鼠的存活、體重變化和腫瘤變化情況，以腫瘤體積抑制率來評價(jià)藥物治療效果，以小鼠體重的降低來評價(jià)藥物的毒性。
　　結(jié)果：
　　從蛋白水平和mRNA水平分別篩選出了高表達(dá)和低表達(dá)葉酸α受體的腫瘤細(xì)胞，表達(dá)量順序如下：KB>BEL-7402>SPC-A-1>SMMC-7721>MCF-7,和表達(dá)葉酸β受體的腫瘤細(xì)胞人髓性白血病 MV4-11和小鼠淋巴瘤白血病

7、 L1210，且蛋白質(zhì)和mRNA水平的檢測結(jié)果基本一致。
　　硫酸銨梯度法制備的葉酸靶向脂質(zhì)體包封率高達(dá)99％以上，重現(xiàn)性良好。優(yōu)化的處方為A以占HSPC的摩爾比計(jì)，DSPE-mPEG2000為2.6%、DSPE-PEG3350-FA為0.4%、粒度為90 nm；B DSPE-mPEG2000為2.6%、CHOL-PEG3350-FA為0.4%、粒度為70 nm。
　　質(zhì)量研究結(jié)果顯示：兩個(gè)處方六批米托蒽醌葉酸靶向脂質(zhì)體的p

8、H值、滲透壓、粒徑、包封率均符合要求，8小時(shí)體外釋放率分別為0.69%、9.30%。穩(wěn)定性結(jié)果顯示：脂質(zhì)體混懸液在2-8℃條件下存放2個(gè)月，上述各指標(biāo)均無明顯變化。
　　對比米托蒽醌游離藥和MIT-L進(jìn)入MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞的藥物攝取發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞攝取量明顯多于MCF-7/ADR細(xì)胞，表明MCF-7/ADR細(xì)胞對游離米托蒽醌產(chǎn)生耐藥性；而對于MIT-FL，MCF-7細(xì)胞攝取量少于MCF-7/ADR細(xì)胞，

9、連有葉酸的脂質(zhì)體與葉酸受體結(jié)合內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，藥物進(jìn)入細(xì)胞的多少與細(xì)胞表面葉酸受體的表達(dá)有關(guān)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物以脂質(zhì)體形式進(jìn)入細(xì)胞后，MIT-FL和MIT-L均可抑制MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞的生長，對于MCF-7細(xì)胞，相同濃度下MIT-FL與MIT-L抑制率的差異不大，而在耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中，相同濃度下MIT-FL的抑制率明顯高于MIT-L。表明以葉酸為靶向機(jī)制通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的脂質(zhì)體可以克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥

10、性。
　　細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于葉酸受體高表達(dá)的細(xì)胞，葉酸靶向脂質(zhì)體相對于無葉酸脂質(zhì)體，攝取率高，靶向性強(qiáng)，對于葉酸受體相對低表達(dá)的細(xì)胞，兩脂質(zhì)體靶向性差異不明顯。此外，靶向脂質(zhì)體進(jìn)入葉酸受體相對高表達(dá)的細(xì)胞的攝取率明顯高于葉酸受體相對低表達(dá)的細(xì)胞，表明當(dāng)脂質(zhì)體表面修飾了葉酸配體后，可提高靶向到葉酸受體高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的能力。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，大單室兩個(gè)脂質(zhì)體處方對細(xì)胞均無抑制作用，米托蒽醌葉酸靶向小單室脂質(zhì)體（MIT-FSL）對

11、細(xì)胞有顯著的抑制作用，經(jīng)計(jì)算其IC50值為3644.3 ng/mL，米托蒽醌無葉酸小單室脂質(zhì)體（MIT-SL）也有抑制作用，其IC50值為32583.8ng/mL。故MIT-FSL抑制作用大于MIT-SL，小單室脂質(zhì)體修飾葉酸后能夠增加向高表達(dá)葉酸受體細(xì)胞內(nèi)的遞送，且能夠在細(xì)胞內(nèi)有效釋放，達(dá)到殺傷細(xì)胞的作用。
　　小鼠接種人KB口腔表皮樣癌移植瘤毒性結(jié)果顯示，游離藥物組的動(dòng)物體重下降較脂質(zhì)體組大，即脂質(zhì)體的毒性低于游離藥物，說明將

12、米托蒽醌包裹于脂質(zhì)體中可降低藥物的毒副作用。藥效結(jié)果表明，各給藥組對腫瘤的生長均有抑制作用，但脂質(zhì)體組對腫瘤的抑制作用弱于游離藥組，推其原因?yàn)橹|(zhì)體相較于游離藥在腫瘤部位的灌注不良，即一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)入腫瘤區(qū)的藥物濃度低于游離藥。另外，脂質(zhì)體的釋放率可能也是導(dǎo)致藥效不能發(fā)揮的原因。
　　結(jié)論：
　　將葉酸修飾于脂質(zhì)體表面，制備得到的葉酸靶向脂質(zhì)體，包封率高，重現(xiàn)性好。其具有兩大優(yōu)勢，一為可有效增加進(jìn)入腫瘤耐藥細(xì)胞的藥物含量，克服