葉酸受體靶向熊果酸長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及其抑瘤作用的研究.pdf

1、研究目的：熊果酸（Urosolic acid，UA）具有廣泛的生物學效應和良好的抗癌效果，但因其水溶性差，使其廣泛應用受到限制。本研究首先制備熊果酸長循環(huán)脂質(zhì)體，再利用葉酸與葉酸受體之間的特異性結(jié)合能力和某些腫瘤細胞表面葉酸受體過度表達的特點，用葉酸修飾的脂質(zhì)材料制備葉酸靶向熊果酸脂質(zhì)體，極大地提高了熊果酸脂質(zhì)體在腫瘤部位的富集，在解決熊果酸溶解性問題的同時，增加腫瘤靶區(qū)組織里的藥物濃度，延長其作用時間，提高抗癌效果，降低藥物的毒副作用

2、，為臨床腫瘤的有效治療提供一種新的思路和方法。
　　研究方法：在本課題的研究中，首先采用經(jīng)典的脂質(zhì)體制備方法薄膜分散法分別制備非靶向熊果酸長循環(huán)脂質(zhì)體（non-targeted PEGylated liposomal UA，PL-UA）和葉酸受體靶向熊果酸長循環(huán)脂質(zhì)體（folate-receptor targeted liposomal UA，F(xiàn)TL-UA），同時考察熊果酸脂質(zhì)體的理化性質(zhì)如粒徑、載藥量、包封率、電位和穩(wěn)定性等各項

3、因素。
　　選擇合適的腫瘤靶向細胞，探討熊果酸脂質(zhì)體的細胞靶向性及體外抑瘤作用，分析PL-UA和FTL-UA對人口腔表皮樣癌（KB）細胞抑制作用上的差異性：利用細胞增殖抑制實驗（MTT）分析熊果酸脂質(zhì)體對KB腫瘤細胞生長抑制作用；Hoechst33258熒光染色分析細胞凋亡的形態(tài)學變化；流式細胞術(shù)分析熊果酸脂質(zhì)體對細胞凋亡率的影響和細胞周期分布的變化；通過Annexin V-FITC/PI雙染的細胞凋亡試驗，定量分析藥物誘導細胞凋

4、亡的具體情況。
　　考察UA脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)藥物代謝動力學及組織分布的特征：通過對小鼠血漿、心、肝、脾、胃、腎等組織的藥物含量進行分析，考察熊果酸隱形納米脂質(zhì)體、游離藥物在體內(nèi)長循環(huán)作用、組織分布上的差異性，為進一步研究葉酸受體靶向脂質(zhì)體在腫瘤治療中的應用提供依據(jù)。
　　考察熊果酸脂質(zhì)體葉酸靶向治療荷瘤鼠人口腔表皮樣癌的作用：在前述實驗研究的基礎(chǔ)上進一步證實FTL-UA是否具有良好的抗腫瘤效果，利用KB細胞表面大量表達葉酸受

5、體的特征，以balb/c裸鼠為研究對象，建立荷瘤鼠人口腔表皮樣癌KB腫瘤模型，通過對該模型尾靜脈注射FTL-UA，觀察其靶向治療荷瘤鼠人口腔表皮樣癌的效果及對荷瘤鼠生存周期的影響，為FTL-UA進一步應用于臨床腫瘤靶向治療提供依據(jù)。
　　實驗結(jié)果：采用薄膜分散法制備的FTL-UA及PL-UA的平均粒徑分別為(160.1±12.5)nm，(151.4±16.1)nm；分散系數(shù)為0.196±0.052，0.168±0.066，粒度分布

6、窄，大小均勻；其電位分別為(-21.24±4.2)mV，(-23.15±6.7)mV；包封率為(88.9±7.9)％，(86.7±12.1)％。在4℃放置3個月后，能維持較好的穩(wěn)定性。
　　在體外，MTT結(jié)果顯示FTL-UA對KB細胞有明顯的殺傷作用，其抑制率呈明顯時間-劑量依賴性，F(xiàn)TL-UA組的IC50值低于PL-UA組（作用72h后的IC50值分別為22.05μM和146.3μM）；細胞周期分布的結(jié)果顯示FTL-UA主要使K

7、B細胞阻滯于S期，即腫瘤細胞的DNA合成期；另外，熒光染色和流式細胞術(shù)分析也證實了FTL-UA能誘導KB細胞凋亡。
　　給6周齡左右小鼠尾靜脈注射20mg/Kg藥物，通過藥物代謝動力學各參數(shù)和組織分布的分析，熊果酸脂質(zhì)體的半衰期、藥-時曲線下面積、表觀分布容積、平均滯留時間和清除率較單純給予游離熊果酸有顯著性差異，表現(xiàn)出明顯的體內(nèi)緩釋和長循環(huán)效應。同時，熊果酸脂質(zhì)體在肝、腎中含量高于其他組織，在其他組織中分布很少，僅有少量組織殘留

8、。
　　建立balb/c裸鼠KB腫瘤模型，尾靜脈分別注射4.5mg/Kg的游離UA、PL-UA及FTL-UA，每隔一天注射一次，連續(xù)給藥5次。其結(jié)果顯示FTL-UA組中每只荷瘤鼠的腫瘤表面有明顯的壞死空洞形成，瘤體逐漸萎縮，明顯抑制腫瘤生長，生存周期也高于其他組。
　　實驗結(jié)論：本實驗研究結(jié)果提示，F(xiàn)TL-UA有望作為新型的化療藥物在人口腔癌化療方面發(fā)揮積極的作用。除了改善熊果酸的溶解性外，還可增加藥物療效，延長體內(nèi)循環(huán)時間