腫瘤靶向的小分子化合物及長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及生物活性研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：Stat3磷酸化抑制劑Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤活性研究
　　 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤,惡性程度增加,對原治療方法敏感性顯著降低,極難治愈,是目前臨床腫瘤治療中遇到的最大難題之一。最新研究認為這種抗治療效應(yīng)是由于腫瘤中存在一類特殊的細胞亞群--腫瘤干細胞(Cancer stem cells)所致,腫瘤干細胞是腫瘤中少數(shù)具有自我更新能力(Self-renewal)并且能產(chǎn)生異質(zhì)性腫

2、瘤細胞的細胞。腫瘤干細胞對化學(xué)治療相對耐藥,對放射治療不敏感。抵抗治療而存活的腫瘤干細胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本因為,因此研究針對腫瘤干細胞的靶向治療將有助于開拓腫瘤治療的新思路,為從根本上治愈腫瘤提供可能。
　　 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是EGFR、IL-6/JAK、SRC等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚的焦點,在多種腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)有持續(xù)性過度激活,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。此外,STAT3能夠調(diào)節(jié)腫

3、瘤干細胞的自我更新能力和增殖能力,對腫瘤干細胞的生長和維持非常重要。這些生物學(xué)信息均提示我們,開發(fā)新的抗腫瘤藥物,STAT3是一個非常具有吸引力的分子靶點。
　　 本課題研究的化合物Flll32,最初設(shè)計的目的就是選擇性靶向到STAT3。初步生物活性研究結(jié)果表明,Flll32特異性作用于JAK2/STAT3,抗腫瘤活性強。但是Flll32水溶性差的缺點,限制了進一步的體內(nèi)生物活性研究,而且水溶性差,很可能會導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度低。

4、而這一問題可以制備脂質(zhì)體劑型來解決。
　　 本文綜述了腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)、生物學(xué)特性以及在實體瘤中的研究進展,本文還綜述了STAT3與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系,并簡單介紹了脂質(zhì)體的特性和作為藥物載體的優(yōu)點。本課題的研究內(nèi)容包括制備Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體,優(yōu)化劑型處方并對脂質(zhì)體的物理參數(shù)進行表征；在此基礎(chǔ)上研究Flll32脂質(zhì)體體內(nèi)外抗腫瘤活性以及對腫瘤干細胞的作用。課題的研究成果包括如下內(nèi)容:
　　 1.以薄膜水化一超聲法

5、制備了Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體,脂質(zhì)體膜材由蛋黃卵磷脂(EPC)、膽固醇(Chol)和甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)組成。通過考察Chol含量、EPC濃度以及藥脂比對Flll32包封率的影響,確定了最佳處方為EPC:Chol:mPEG2000-DSPE:Flll32=18:2:1:2(摩爾比),其中EPC濃度為18mM。根據(jù)該處方制備的長循環(huán)脂質(zhì)體,Flll32包封率高達97％以上,平均粒度為

6、91.29±1.19nm(n=3)。
　　 2.體外抗腫瘤活性研究中,通過細胞活性測定實驗(WST-8法),檢測化合物的細胞毒性；通過克隆形成實驗,評價化合物對細胞增殖的影響；聯(lián)合細胞周期測定、WesternBlot檢測Cleaved PARP和Caspase-3功能活化測定實驗,檢測細胞凋亡；從蛋白和基因水平,評價化合物對STAT3及下游靶基因的影響。實驗結(jié)果表明,Flll32能夠有效抑制胰腺癌細胞的STAT3磷酸化,降低下游

7、靶基因Bcl-xL(2)、Survivin、Cyclin D1和c-Myc的表達水平,進而抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡；Flll32與化療藥物聯(lián)合使用具有協(xié)同作用,與放射治療聯(lián)合使用具有放射增敏作用。Flll32脂質(zhì)體短時間作用活性稍弱于游離化合物,但長時間作用活性則強于游離化合物,且表現(xiàn)出安全性更高的優(yōu)點。
　　 3.體內(nèi)抗腫瘤活性研究中,通過繪制腫瘤生長曲線和體積倍增曲線,評價化合物的抗腫瘤活性。實驗結(jié)果表明,Flll32及其

8、脂質(zhì)體有效抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長延緩腫瘤倍增,而該作用是通過抑制STAT3磷酸化產(chǎn)生的。Flll32脂質(zhì)體與放射治療聯(lián)合使用,幾乎完全抑制腫瘤生長,效果大大優(yōu)于二者單獨使用,協(xié)同作用明顯。
　　 4.對腫瘤干細胞作用的研究中,Tumorsphere形成實驗檢測化合物對腫瘤干細胞自我更新能力的影響；以流式細胞儀檢測ALDH+細胞比例,反映化合物對腫瘤干細胞比例的影響。實驗結(jié)果表明,Flll32及其脂質(zhì)體有效抑制Tumorsphere

9、形成數(shù)目和體積,下調(diào)Panc1細胞和Panc1細胞移植瘤組織中ALDH+細胞比例,同時還能中和放射治療升高ALDH+細胞比例的作用。因此推斷Flll32作為STAT3磷酸化抑制劑,在殺死普通腫瘤細胞的同時也能殺死腫瘤干細胞。
　　 第二部分：Gefitinib類似物生物活性篩選及優(yōu)選化合物抗腫瘤活性研究
　　 分子靶向治療是近十年來逐漸發(fā)展起來的腫瘤治療的新手段,所謂分子靶向治療,是以腫瘤相關(guān)的分子為靶點,將藥物等有效成

10、分靶向定位到癌細胞,從而達到治療腫瘤的目的。彌補了傳統(tǒng)腫瘤治療方法選擇性低、毒副作用大的缺點。
　　 EGFR是第一個與人腫瘤直接相關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶,在多種上皮來源的實體瘤中表現(xiàn)出過表達；EGFR的活化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,因為EGFR信號通路與促進細胞增殖和存活、抑制細胞凋亡相關(guān)。因此EGFR是腫瘤分子靶向治療中一個很有吸引力的分子靶點。隨著作用于EGFR小分子抑制劑Gefitinib、Erlotinib和La

11、patinib相繼進入臨床使用,更是說明了人們對于EGFR作為分子靶點的關(guān)注。本文綜述了EGFR與腫瘤的密切關(guān)系,以及作用于EGFR的酪氨酸激酶小分子抑制劑的研究進展。對本實驗室以Gefitinib為先導(dǎo)化合物而設(shè)計合成的20個類似物進行抑制激酶活性和細胞毒性的生物活性篩選,對活性較好的化合物作進一步體內(nèi)外抗腫瘤活性和作用機制研究。課題的研究成果包括如下內(nèi)容:
　　 1.生物活性篩選中,通過細胞活性測定實驗(WST-8法),檢測

12、化合物的細胞毒性；使用激酶檢測試劑盒,通過ELASA法體外檢測激酶活性,考察化合物對激酶活性的抑制作用。結(jié)果表明,大部分新化合物對測試的6種人腫瘤細胞的細胞毒性均強于Gefitinib,抗腫瘤活性增強,但是對EGFR激酶的抑制作用均有不同程度的降低；化合物12、15、17、18和19有可能同時作用于EGFR、HER-2和c-MET,成為多受體酪氨酸激酶抑制劑。
　　 2.對優(yōu)選化合物15和17的體外抗腫瘤活性研究中,通過檢測細胞

13、生長曲線和克隆形成實驗,評價化合物對細胞生長和增殖的影響；聯(lián)合細胞周期測定、Western Blot檢測Cleaved PARP和Caspase-3功能活化測定實驗,檢測細胞凋亡；聯(lián)合Western Blot檢測LC3-Ⅱ和轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒觀察斑點狀分布,檢測細胞自噬。研究結(jié)果表明,化合物15和17對HER-2高表達的人胰腺癌細胞Miapac2生長和增殖的抑制活性大大強于Gefitinib；化合物15和17通過誘導(dǎo)凋亡和自噬兩種方

14、式促進Miapac2細胞死亡,Gefitinib只通過較弱的誘導(dǎo)自噬的方式殺死細胞。這可能就是化合物15和17體外抗腫瘤活性大大強于Gefitinib的因為。
　　 3.對優(yōu)選化合物15和17的體內(nèi)抗腫瘤活性研究中,通過對預(yù)處理細胞成瘤能力的檢測,評價化合物抑制腫瘤形成的能力；通過繪制腫瘤生長曲線和體積倍增曲線,評價化合物的抗腫瘤活性。與Gefitinib相比,化合物15和17能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的形成；相同劑量處理荷瘤裸鼠,