新型高度肺靶向脂質體DTX-LP的研制及抗腫瘤活性評價.pdf

1、背景：
　　肺癌是一種最常見的惡性腫瘤，現(xiàn)已成為惡性腫瘤死亡的首要原因，其中以非小細胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）發(fā)病率最高。當前對此類患者多以手術或放療結合化療方法進行綜合性治療，防止腫瘤的轉移與復發(fā)，但臨床上現(xiàn)有的化療藥物（如鉑類藥物、多烯紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱等）存在用藥量大、毒副作用較大等問題，究其原因主要是這些化療藥物因缺乏靶向性，為此，能構建一種高效肺靶向給藥系統(tǒng)就十分必要且迫

2、在眉睫。
　　目的：
　　本文針對多烯紫杉醇注射液（DocetaxelInjection,DTX-IN）與普通脂質體劑型在臨床上使用出現(xiàn)的毒副作用大、臨床安全性差以及質量不穩(wěn)定等問題，選擇脂質體作為靶向給藥系統(tǒng)，以多烯紫杉醇為模型藥物，采用固體分散技術與水化技術組合，創(chuàng)制微米級特定尺寸的多烯紫杉醇脂質體（DocetaxelLiposomes,DTX-LP），以期構建一種高效肺靶向脂質體給藥系統(tǒng)，解決DTX-LP的肺靶向給藥與

3、脂質體制備的瓶頸技術等問題，為開發(fā)具有自主知識產權且能臨床安全應用的肺靶向DTX-LP提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用正交試驗設計方法，對DTX-LP制備工藝進行優(yōu)化，提高了載藥量，改善了其流動性，并確定了DTX-LP粉末的最佳水化條件。
　　2.建立DTX-LP中DTX的HPLC分析方法，進行其方法學考察。
　　3.采用固定漏斗方法，考察了DTX-LP粉末的流動性。
　　4.采用傅里葉紅外光譜方法

4、，研究了DTX-LP粉末中DTX與各輔料間的相互作用。
　　5.采用X射線粉末衍射方法，研究了DTX-LP粉末中DTX的存在形式。
　　6.采用細胞計數(shù)方法，計數(shù)了DTX-LP中的脂質體。
　　7.采用頂空氣相色譜方法，檢測了DTX-LP中乙醇的殘留量。
　　8.采用內毒素檢查、熱原檢查和無菌檢查等方法，對DTX-LP進行了生物學檢定。
　　9.采用锝（99mTc）核素標記技術方法，制得了DTX-LP的锝（

5、99mTc）核素標記物99mTc-DTX-LP。
　　10.采用羅丹明B（RhodamineB,RhB）熒光標記技術方法，制得了DTX-LP的紅色熒光標記物RhB-DTX-LP。
　　11.采用SPECT/CT技術，建立了99mTc-DTX-LP的兔肺靶向作用研究方法，考察了99mTc-DTX-LP在兔體內的分布情況。
　　12.采用激光掃描共聚焦顯微鏡方法，研究了RhB-DTX-LP在裸鼠體內的分布情況；研究了綠色熒

6、光標記的人肺癌細胞株A549對RhB-DTX-LP的攝取及其在細胞內的定位情況。
　　13.采用MTT方法，評價了DTX-LP對不同組織來源腫瘤細胞株的體外抗腫瘤活性。
　　14.構建兔的VX2肺癌模型，研究了DTX-LP的藥效學。
　　結果：
　　1.經DTX-LP的制備工藝優(yōu)化及其水化試驗研究表明：水化劑為滅菌注射用水（1g:10mL）；水化溫度為55±1℃，水化時間為3min，DTX-LP質量與容器體積比為

7、1g:100mL，振搖頻率為30次/min。
　　2.經DTX-LP質量評價研究表明：①DTX-LP粉末的紅外圖譜顯示DTX與各輔料之間未發(fā)生化學反應；②DTX-LP粉末的X-射線粉末衍射圖譜顯示DTX以無定形或以分子形態(tài)分散在載體材料中；③三批次DTX-LP（20110729、20111111和20111021）的休止角（38.5±0.3°、35.0±0.2°和36.1±0.1°）、疏松堆密度（0.334±0.013、0.404

8、±0.021和0.413±0.015g/cm3）和振實堆密度（0.475±0.026、0.539±0.016和0.554±0.022g/cm3）等指標符合固體制劑流動性的要求；而脂質體計數(shù)則分別為2.56±0.21×108、2.81±0.18×108和2.42±0.22×108（個/mL）；④DTX-LP中乙醇的殘留量為0.0015±0.0003％；⑤DTX-LP形態(tài)圓整、分散性好和粒徑分布均勻，其粒徑、電荷、pH、包封率和載藥量分別為

9、0.85±0.26μm、-27±0.35mv、5.4±0.2（n=3）、91.92±0.38%（n=3）和0.66±0.01%（n=3）；⑥DTX-LP經0.9%生理鹽水稀釋后在4h內穩(wěn)定性較好；⑦經細菌內毒素檢查結果顯示DTX-LP呈陰性；⑧經家兔熱原實驗結果顯示各實驗兔體溫升高均未超過0.6℃，且3只家兔體溫升高總和為0.1℃,低于中國藥典規(guī)定的1.4℃；⑨經無菌（需氧菌、厭氧菌、真菌）檢查結果顯示DTX-LP呈陰性。
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10、.在DTX-LP的體外腫瘤細胞攝取實驗中，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察技術方法，觀察到RhB-DTX-LP能進入人肺癌細胞株A549的細胞內（因細胞質中出現(xiàn)了RhB-DTX-LP的紅色熒光所示），并且主要濃集在細胞核及其周圍。
　　4.在DTX-LP的荷人肺癌細胞株A549裸鼠實驗中，研究表明：經腹腔注射的RhB-DTX-LP主要分布在肺部和移植瘤組織中，而羅丹明B注射液（RhodamineBInjection，RhB-IN）無器

11、官或組織選擇性。
　　5.在DTX-LP的兔實驗中，研究表明：經兔耳緣靜脈注射的99mTc-DTX-LP主要呈現(xiàn)肺部的放射性影像，而Na99mTcO4溶液呈現(xiàn)口腔、鼻咽腔、甲狀腺、心臟、腎臟、膀胱等放射性影像。
　　6.經體外抗腫瘤活性研究表明：DTX-LP對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的IC50值為1.97±0.29μg/mL；對人肺癌細胞株A549的IC50值為3.04±0.10μg/mL；對人肝癌細胞株QGY-7

12、701的IC50值為4.99±0.32μg/mL。
　　7.經藥效學實驗表明：空白脂質體（BlankLiposomes，BLA-LP）組、DTX-IN陽性對照組（2.0mg/kg）、DTX-LP低劑量組（0.25mg/kg）、DTX-LP中劑量組（0.5mg/kg）、DTX-LP高劑量組（1.0mg/kg）的荷瘤兔中位生存期分別為31天、32天、42天、42天和61天；體重平均下降率分別為23.03%、11.25%、17.27%、

13、2.08%及和1.43%。DTX-LP不良反應發(fā)生率以及對實驗兔心、肝、脾、肺和腎損害均較DTX-IN組輕微。
　　結論：
　　1.成功建立了DTX-LP的最佳制備工藝，制得的DTX-LP粉末流動性好，載藥量高，適合批量生產，該工藝具有工業(yè)化生產的前景。
　　2.完善了DTX-LP的質量評價標準。
　　3.建立了脂質體的計數(shù)方法。
　　4.在內毒素檢查、熱原檢查和無菌檢查等結果顯示，DTX-LP的這些指標均

14、符合注射液要求。
　　5.在荷人肺癌細胞株A549裸鼠的實驗中表明，RhB-DTX-LP對肺部和移植瘤組織具有高度的靶向作用。
　　6.在兔的實驗中表明，99mTc-DTX-LP具有高度的肺靶向性。
　　7.由裸鼠和兔的實驗中表明，DTX-LP不論靜脈注射還是腹腔注射都具有高度的肺靶向性。
　　8.基于兔VX2肺癌模型的藥效學研究結果顯示，DTX-LP可顯著延長荷VX2肺癌實驗兔的生存期，尤其是DTX-LP高劑量