新型抗腫瘤納米載藥體系在肺癌治療中的應用.pdf

1、背景:全球每年肺癌的發(fā)病率居首位，同時也是第一位常見的腫瘤死亡原因。迄今為止，手術(shù)切除被認為是治療肺癌的主要手段，然而，大部分的肺癌病人就診時已屬于進展期，單純手術(shù)療效有限，因此化療在肺癌治療中占有極其重要的地位?；熞驯蛔C實可以提高治療效果、延長生存時間。紫杉醇(Paclitaxel，Ptx)，作為化療領(lǐng)域中里程碑式的藥物，在肺癌治療中也作為一線方案的重要組成部分被列入NCCN肺癌臨床實踐指南中。盡管如此，但其單藥或者聯(lián)合化療的有效率

2、均小于50％。此外，中藥單體小分子化合物漢防己甲素(Tetrandrine，Tet)也在我們前期研究中被證實具有潛在抗腫瘤效應。因此如何減少化療藥物的毒副作用且能夠發(fā)現(xiàn)新型的潛在藥物來增加化療效果成為抗腫瘤藥物研發(fā)中的一個非常重要的問題。納米載藥體系不僅具有改善水溶性較差藥物的水相溶解度，增加其穩(wěn)定性，從而獲得控制釋放等傳統(tǒng)藥物輸送體系所具有的作用外，由于應用了不同的設(shè)計理念，在抗腫瘤藥物輸送中又具有許多獨特的應用優(yōu)勢。
　　目的

3、:本研究構(gòu)建了兩種不同的納米載藥體系。首先采用自行合成的聚吡咯烷酮-聚己內(nèi)脂(PVP-PCL)兩親嵌段共聚物，用納米沉淀法制備了漢防己甲素載藥納米微球(Tet-NPs)。同時，我們基于Carrier free的概念合成了Ptx-SA小分子化合物，通過其自組裝構(gòu)建了負載紫杉醇的Ptx-SA載藥納米纖維。在隨后的研究中考察了兩種載藥納米體系的穩(wěn)定性、緩釋效應以及體外與體內(nèi)協(xié)同抑瘤活性來考察載藥納米體系在肺癌治療中的優(yōu)勢，為這兩種新型的納米給

4、藥體系的繼續(xù)研發(fā)提供實踐基礎(chǔ)。
　　方法:用化學合成法合成了PVP-PCL二嵌段共聚物以及Ptx-SA小分子化合物。用原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察兩種載藥體系的形貌，并用動態(tài)光散射儀和Zeta電位測定儀檢測載藥納米體系的粒徑大小和表面電位。同時采用高效液相色譜(HPLC)測定載藥納米體系的載藥效率，并且考察兩種載藥體系的體外緩釋特性。在體外細胞及體內(nèi)動物模型上研究載藥納米微球的抗腫瘤效果及其可能的機制。
　　結(jié)果:第一，

5、本文中所構(gòu)建的Tet-NPs在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察下呈現(xiàn)為較規(guī)則的表面光滑的球形，粒徑比較均一，在120nm左右。其載藥量為18.2％左右。Tet-NPs具有良好的穩(wěn)定性以及體外緩釋特征。且?guī)в袩晒馐聚櫟腡et-NPs能夠在與細胞共孵育的短時間內(nèi)有效的進入細胞。Tet-NPs的誘導凋亡的效果顯著強于Tet裸藥。同等劑量下Tet-NPs比Tet裸藥能夠更為有效的調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達。此外，Tet-NPs比同等劑量下的裸藥

6、能夠更為顯著抑制肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能為通過調(diào)控MMP相關(guān)蛋白的表達。
　　第二，Ptx-SA在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察下呈現(xiàn)為直徑為30-40nm，長約1-3um的纖維狀結(jié)構(gòu)。隨后的體外釋放實驗證實了該載藥納米纖維良好的體外緩釋性。細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)Ptx-SA載藥纖維具有良好的親細胞性。Ptx-SA與Ptx裸藥所顯示的細胞毒效應的效果都具有濃度依賴性，且Ptx-SA的效果強于Ptx裸藥。Western bl

7、ot結(jié)果顯示同等劑量下Ptx-SA比Ptx裸藥能夠更為有效的調(diào)控Akt蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達。在體內(nèi)肺癌模型上也證實了Ptx-SA比Ptx裸藥更為有效的抑瘤效果。
　　結(jié)論:本文中所構(gòu)建的兩種載藥納米體系在體外以及體內(nèi)均顯示出了良好的抗腫瘤效果，并且在體內(nèi)外的療效評價中證實了相比于裸藥的優(yōu)越性?？梢?，制備新型的納米載藥體系，是抗腫瘤藥物發(fā)展的新方向，具有良好的實用價值和發(fā)展前景。
　　第一部分漢防己甲素高分子納米載藥體系的

8、構(gòu)建及其在肺癌治療中的評價
　　目的:采用生物相容性較好的高分子材料構(gòu)建負載漢防己甲素的高分子載藥納米微球，考察其理化特性等各項特征，在體外細胞模型上評價該載藥納米微球的細胞毒效應及抗轉(zhuǎn)移效果，同時研究其相關(guān)作用的可能機制。
　　方法:用開環(huán)聚合法制備PVP-PCL兩親嵌段共聚物，采用溶劑分散法制備負載漢防己甲素的PVP-PCL納米載藥微球(Tet-NPs)。用TEM和SEM觀察Tet-NPs的形態(tài)，并用動態(tài)光散射儀和Zet

9、a電位儀測定Tet-NPs的粒徑和表面電位。通過高效液相色譜法檢測Tet-NPs的載藥效率，并且測定該微球的體外釋放曲線。采用FACS測定Tet及Tet-NPs對人肺癌細胞系的凋亡誘導效果。吖啶橙染色后用熒光顯微鏡觀察Tet-NPs所誘導的肺癌細胞的凋亡情況。采用劃痕實驗和Transwell實驗檢測Tet-NPs對于肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的效果。最后用western blot檢測相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果:Tet-NPs在掃描電子顯微

10、鏡和透射電子顯微鏡的觀察下呈現(xiàn)為較規(guī)則的表面光滑的球形，粒徑比較均一，在120nm左右。Tet-NPs的載藥效率令人滿意，載藥量為18.2％左右，包封率超過了90％。FTIR紅外光譜圖證實了Tet成功的被載入Tet-NPs中，且以物理包埋的形式被負載入載體材料中。Tet-NPs具有良好的穩(wěn)定性以及體外緩釋特征。細胞攝取實驗顯示了負載香豆素-6的Tet-NPs能夠在與細胞共孵育的2h內(nèi)有效的進入細胞，且該種胞吞過程與溫度有關(guān)，并且可以被疊

11、氮化鈉所部分阻斷。Tet-NPs與Tet裸藥所顯示的誘導凋亡的效果都具有濃度依賴性，且Tet微球的誘導凋亡的效果顯著強于Tet裸藥。Western blot結(jié)果顯示同等劑量下Tet-NPs比Tet裸藥能夠更為有效的調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達。此外，劃痕實驗和Transwell實驗均證實Tet-NPs比同等劑量下的裸藥能夠更為顯著抑制肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能為通過調(diào)控MMP相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)論:本文報道了一種穩(wěn)定簡便的采用

12、PVP-PCL為高分子載體負載漢防己甲素的納米載藥微球的穩(wěn)定的制備方法，并證實該載藥微球微球具有強于裸藥的親細胞性、體外抑瘤及抗轉(zhuǎn)移等效果，且可能通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達來介導的。因此，我們所制備的漢防己甲素載藥納米遞藥系統(tǒng)作為一種新型的肺癌治療的納米制劑值得進一步深入研究。
　　第二部分基于Carrier free概念自組裝的紫杉醇納米載藥纖維的構(gòu)建與體內(nèi)外抗肺癌效果評價
　　目的:基于Carrier free概念構(gòu)建自組裝

13、對的紫杉醇納米載藥纖維(Ptx-SA)，考察其理化特性等各項特征，在體外細胞模型和體內(nèi)動物模型上評價該載藥納米纖維的細胞毒效應，同時研究其相關(guān)作用的可能機制。
　　方法:化學合成法合成Ptx-SA后制備負載紫杉醇的載藥納米纖維(Ptx-SA)。用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察Ptx-SA的形態(tài)，并用動態(tài)光散射儀和Zeta電位儀測定Ptx-SA的粒徑和表面電位。通過高效液相色譜法檢測Ptx-SA的載藥量和包封率，并且考察該載藥納

14、米纖維的體外釋放特征。采用XTT法測定其對人肺癌細胞系的細胞殺傷效果。western blot檢測相關(guān)蛋白的表達。在肺癌動物模型上考察其體內(nèi)抗腫瘤療效。
　　結(jié)果:Ptx-SA在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察下呈現(xiàn)為直徑為30-40nm，長約1-3um的纖維狀結(jié)構(gòu)。載藥量為89.5％左右。隨后的體外釋放實驗證實了該載藥納米纖維良好的體外緩釋性。細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)Ptx-SA載藥纖維在短暫的孵育過程中可以有效地穿透細胞膜進入細胞

15、內(nèi)。Ptx-SA與Ptx裸藥所顯示的細胞毒效應的效果都具有濃度依賴性，且Ptx-SA的效果顯著強于Ptx裸藥。Western blot結(jié)果顯示同等劑量下Ptx-SA比Ptx裸藥能夠更為有效的調(diào)控Akt蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達。在體內(nèi)肺癌模型上也證實了Ptx-SA比Ptx裸藥更為有效的抑瘤效果。
　　結(jié)論:本文報道了一種新型的基于Carrier free概念構(gòu)建的自組裝Ptx-SA載藥納米纖維，并且發(fā)現(xiàn)該載藥纖維具有優(yōu)于裸藥的親細胞