LRP受體介導(dǎo)的腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥系統(tǒng)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80％。由于膠質(zhì)瘤呈惡性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且多生長(zhǎng)在腦的重要區(qū)域，手術(shù)難度大、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、病人預(yù)后差。所以化療是膠質(zhì)瘤諸多治療環(huán)節(jié)中至關(guān)重要的一環(huán)，其成敗直接影響病人的生活質(zhì)量和預(yù)后。然而，由于膠質(zhì)瘤自身的生長(zhǎng)特點(diǎn)和血腦屏障(BBB)存在，目前臨床化療效果極其不理想。以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，以納米靶向遞藥系統(tǒng)為載體，通過(guò)制劑學(xué)手段克服腦膠質(zhì)瘤化療屏障極具潛力。

2、>　　本課題以紫杉醇(PTX)為膠質(zhì)瘤化療模型藥物，PEG化聚己內(nèi)酯(PEG-PCL)為載體材料，構(gòu)建可以被動(dòng)靶向于膠質(zhì)瘤部位的納米粒遞藥系統(tǒng)(PEG-NP);進(jìn)一步以Angiopep-2為靶向頭基，對(duì)PEG-NP主動(dòng)靶向修飾，旨在構(gòu)建一種通過(guò)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)受體介導(dǎo)，既可以靶向BBB，又可以靶向膠質(zhì)瘤的雙級(jí)靶向遞藥系統(tǒng)，為探索膠質(zhì)瘤靶向治療提供靶向策略與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本文的主要內(nèi)容包括如下五個(gè)部分:(1) P

3、EG化PCL聚合物納米粒構(gòu)建與表征;(2) PEG-PCL共聚物納米粒遞藥系統(tǒng)體內(nèi)研究;(3) Angiopep-2修飾PEG-PCL納米粒構(gòu)建及腦內(nèi)遞送特性研究;(4) Angiopep-2修飾PEG-PCL納米粒膠質(zhì)瘤靶向性研究;(5) Angiopep-2修飾PEG-PCL納米粒雙級(jí)靶向評(píng)價(jià)及體內(nèi)初步安全性研究。
　　首先，通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合法合成了PEG-PCL嵌段共聚物，利用乳化/溶劑蒸發(fā)法制備了負(fù)載PTX的納米粒(PEG-N

4、P-PTX)，以納米粒徑、載藥量和包封率為指標(biāo)，篩選和優(yōu)化了納米粒制備條件，較優(yōu)工藝和參數(shù)為:聚合物濃度25 mg/mL，表面活性劑膽酸鈉濃度為0.5％，油水比例為1∶10，PTX投藥量為10％。按照較優(yōu)工藝制備的PEG-NP-PTX經(jīng)理化表征可得:PEG-NP-PTX的包封率為90.4％左右;載藥量為8.2％;粒徑為70 nm左右，形態(tài)圓整、均勻，表面電位近中性;DSC顯示PTX以無(wú)定形或固態(tài)溶液分散于納米粒骨架中;PEG化增加了聚合

5、物納米粒的穩(wěn)定性; PEG-NP-PTX具有一定緩控釋作用;體外抗C6細(xì)胞毒性?xún)?yōu)于或相當(dāng)于Taxol注射液。
　　其次，對(duì)PEG-NP-PTX進(jìn)行了體內(nèi)研究，SD大鼠藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明PEG-NP-PTX長(zhǎng)循環(huán)效果顯著優(yōu)于Taxol和NP-PTX組;其AUC0→t是Taxol組2.7倍，是NP-PTX組的4.8倍。MRT顯著增加，CL顯著減小;C6原位膠質(zhì)瘤小鼠活體熒光成像結(jié)果表明PEG-NP可以通過(guò)腫瘤EPR效應(yīng)富集于膠質(zhì)瘤部位，半

6、定量結(jié)果顯示PEG-NP組腦部熒光強(qiáng)度AUC是NP的4倍;PEG-NP-PTX在原位膠質(zhì)瘤小鼠血液和膠質(zhì)瘤組織蓄積顯著高于Taxol組和NP-PTX組，而在正常腦組織部位的蓄積沒(méi)有明顯增加;以C6原位膠質(zhì)瘤小鼠為模型，初步考察了PEG-NP-PTX的抗膠質(zhì)瘤藥效，結(jié)果表明，PEG化PTX納米粒可以顯著增強(qiáng)PTX的抗膠質(zhì)瘤效果。
　　第三，利用納米粒表面暴露的馬來(lái)酰亞胺殘基與含巰基的Angiopep(ANG)共價(jià)結(jié)合，成功構(gòu)建了AN

7、G修飾的PEG-PCL納米粒(ANG-PEG-NP);以粒徑和ANG修飾密度為指標(biāo)，優(yōu)化的ANG-PEG-NP較優(yōu)制備條件為:Male-PEG-PCL與Me-PEG-PCL質(zhì)量比為1∶9;馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與Angiopep摩爾比為3∶1;孵育時(shí)間為8 h;理化表征表明ANG修飾沒(méi)有顯著改變納米粒的理化性質(zhì);以RBITC作為納米粒的熒光探針，考察了ANG-PEG-NP在體內(nèi)外的腦部遞藥性能。ANG-PEG-NP顯著增加納米粒的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮

8、細(xì)胞(BCEC)攝取，ANG-PEG-NP的BCEC內(nèi)吞需要能量，可進(jìn)入溶酶體，經(jīng)LRP受體介導(dǎo)，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的和陷穴小泡介導(dǎo)的兩種內(nèi)吞途徑入胞;ANG-PEG-NP對(duì)BCEC細(xì)胞毒性較低;小鼠腦組織分布顯示，ANG-PEG-NP在大腦皮層、側(cè)腦室脈絡(luò)叢、第三腦室及室周區(qū)和海馬區(qū)分布均明顯高于PEG-NP，被Angiopep-2競(jìng)爭(zhēng)飽和后又可以明顯抑制ANG-PEG-NP的腦內(nèi)分布，說(shuō)明ANG-PEG-NP通過(guò)LRP介導(dǎo)能夠增加藥物

9、的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，具有一定的腦部靶向性。
　　第四，研究了ANG-PEG-NP對(duì)膠質(zhì)瘤的主動(dòng)靶向性，ANG-PEG-NP可顯著增加U87 MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的攝取，該過(guò)程主要由陷穴小泡介導(dǎo)內(nèi)吞，通過(guò)溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，并具有濃度、時(shí)間和溫度依賴(lài)性，可以被游離LRP配體抑制;通過(guò)U87 MG細(xì)胞毒、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和體內(nèi)外三維實(shí)體膠質(zhì)瘤模型等研究表明ANG-PEG-NP通過(guò)LRP受體介導(dǎo)，具有明顯膠質(zhì)瘤主動(dòng)靶向性。
　　第五， BCEC-U8