雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機制研究.pdf

1、腎癌發(fā)源于泌尿小管上皮，是成人中常見的惡性腫瘤之一。早期可以手術切除，但術后一部分患者仍然發(fā)生轉移，晚期則失去手術根治機會，并且缺乏特效治療方法。雖然細胞因子及分子靶向藥物等對腎癌有一定的療效，但總體效果均不夠理想。而惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因的功能改變密切相關，因此探索基因療法具有積極意義，也是腎癌治療的長期研究熱點。
　　NPRL2(nitrogen permease regulator-like2)是近年來新發(fā)現(xiàn)與熱點研究的抑

2、癌基因之一，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后關系密切。課題組前期發(fā)現(xiàn)NPRL2在腎癌組織中的表達較癌旁正常組織明顯下降，轉染外源性NPRL2基因對腎癌細胞具有明顯的抑制作用，提示NPRL2在腎癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。但利用傳統(tǒng)的轉基因技術將外源基因導入腫瘤宿主細胞，存在轉染效率低、基因突變及丟失等一系列問題，而新的轉導肽CTP可高效攜帶蛋白質穿透胞膜并專性定位于胞漿，提供了解決問題的可能性。在基因治療研究中，應用的載體系統(tǒng)主要有病毒和

3、非病毒（脂質體等）兩大類，前者存在病毒滴度低、缺乏安全性與引起突變等缺點，后者也存在缺乏腫瘤靶向性、轉染效率低等缺點，而雙歧桿菌為腸道重要的厭氧益生菌，對腫瘤低氧區(qū)具有特異靶向性，是一種良好的腫瘤基因治療靶向載體。
　　本課題在前期基礎之上對抑癌基因NPRL2進行深一步的研究，利用CTP顯著的胞漿定位與高效的轉導潛能，率先提出了“通過NPRL2與CTP融合表達來實現(xiàn)外源性NPRL2蛋白“內源化”的策略。通過原核表達CTP-NPRL

4、2融合蛋白，利用CTP的轉導功能將NPRL2蛋白轉入腎癌細胞后觀察細胞生物學行為的改變，同時以雙歧桿菌為載體在裸鼠腎癌模型上進行實驗以評估療效，最終運用基因芯片、蛋白質譜等技術初步揭示雙歧桿菌介導 CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機制，以期為腎癌尋找到一種新的基因治療方法。本論文總共分兩部分。
　　第一部分、CTP轉導NPRL2蛋白對人腎癌細胞786-O生物學行為的影響
　　目的：證實CTP能夠轉導NPRL2蛋白進入人腎

5、癌細胞786-O并對該細胞的生物學行為產生影響。
　　方法：
　　1.構建重組質粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2并分別轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導蛋白表達并Western blot驗證。
　　2.FITC分別標記CTP-NPRL2和NPRL2兩種蛋白，激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白在細胞中的定位，F(xiàn)ACS檢測轉導效率。
　　3.根據(jù)作用蛋白的不同將實驗分為CTP-NPR

6、L2組、NPRL2組及空白對照組，每組均處理786-O，CCK-8法檢測細胞增殖，F(xiàn)ACS檢測細胞周期與凋亡，Transwell法檢測細胞侵襲及遷移能力。
　　結果：
　　1.重組質粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2轉化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)Western blot驗證能夠表達出目的蛋白。
　　2.激光共聚焦顯微鏡顯示CTP-NPRL2組細胞內可見綠色熒光并顯著定位于胞漿，而NPRL

7、2組及空白對照組未見綠色熒光。FACS顯示CTP-NPRL2融合蛋白以75%左右的高效率轉入腎癌細胞786-O，而NPRL2蛋白幾乎不能進入該細胞。
　　3.與NPRL2組及空白對照組相比，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)CTP-NPRL2組細胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05），F(xiàn)ACS顯示CTP-NPRL2組的凋亡率顯著增高（P＜0.01）且處于G0/G1期細胞明顯增多（P＜0.05），Transwell顯示CTP-NPRL2組細胞侵襲及遷移

8、能力明顯降低（P＜0.01）。同時CTP-NPRL2融合蛋白隨其濃度增加而作用增強。NPRL2組與空白對照組以上比較均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結論：CTP能夠高效轉導NRPL2蛋白進入腎癌細胞786-O并對該細胞產生腫瘤抑制作用，并且隨CTP-NPRL2融合蛋白濃度增加而作用增強。
　　第二部分、雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的療效及機制研究
　　目的：探討雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療裸鼠

9、腎癌模型的療效，并利用基因芯片與蛋白質譜檢測結果綜合分析的策略探索相應的分子機制，以期從整體水平上揭示該治療方法的作用原理，并篩選出關鍵性的靶基因。
　　方法：
　　1.786-O細胞懸液皮下注射法構建裸鼠腎癌模型，通過病理切片證實模型是否構建成功。
　　2.厭氧法培養(yǎng)嬰兒雙歧桿菌，電轉法將重組質粒pET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2及空質粒轉化感受態(tài)雙歧桿菌，Western blot驗證目的蛋白

10、的表達。
　　3.將建模成功的裸鼠腎癌模型40只按處理因素不同隨機分為5組：雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組、雙歧桿菌+pET15b-NPRL2組、雙歧桿菌+pET15b組、雙歧桿菌組與生理鹽水組，每組8只，尾靜脈注射各菌液或生理鹽水，每周1次，共4次。
　　4.通過觀察裸鼠重量、瘤體重量、雙腎重量及TUNEL檢測腫瘤組織凋亡情況以評估療效。
　　5.基因芯片與蛋白質譜檢測分別尋找經(jīng)雙歧桿菌介導CTP-NP

11、RL2處理后的裸鼠腎癌組織差異表達基因與蛋白，并進行 GO、Pathway、Pathway-network等生物信息學分析，結合閱讀文獻，推斷雙歧桿菌介導CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機制。
　　6.篩選出可能的靶點基因，Real time-PCR、Western blot驗證表達。
　　7.選取代表性的靶基因，構建3條針對該基因的干擾 siRNA序列以及1條無義siRNA序列，Real time-PCR篩選最適干擾s

12、iRNA序列；構建針對該基因的重組質粒。
　　8.探討代表性靶基因對786-O生物學行為的影響，將實驗分為干擾siRNA組、無義siRNA組、空白對照組、重組質粒組與空質粒組，處理786-O細胞，Real time-PCR和Western Blot檢測每組代表性基因的表達，CCK-8法檢測細胞增殖，F(xiàn)ACS檢測細胞周期與凋亡。
　　結果：
　　1.裸鼠皮下生長出腫塊并經(jīng)病理切片證實為腎癌。
　　2.電轉重組質粒p

13、ET15b-CTP-NPRL2、pET15b-NPRL2及空質粒后雙歧桿菌能夠良好生長，經(jīng)Western blot驗證表達出目的蛋白。
　　3.雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組裸鼠重量明顯改善，瘤體重量減輕，與其余任意一組相比具有顯著差異(均 P＜0.01)，而剩余各組之間無明顯差異(均 P＞0.05)，雙腎重量在各組間亦無明顯差異(均P＞0.05)。雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組凋亡率（26.8±4.1

14、5）%與生理鹽水組凋亡率（11.6±3.58）%有顯著差異(P＜0.01)。
　　4.基因芯片篩選出雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織差異表達2倍以上基因565個，其中313個在雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組表達上調，252個表達下調；GO分析顯著富集的Term中與腫瘤相關的有：細胞增殖、細胞遷移、細胞移動、細胞增殖的調控、細胞遷移的調控等；Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相

15、關的有：細胞外基質組建、G0/G1早期、整合素介導的細胞表面相互粘附、細胞周期等；Pathway-network分析處于中心地位的Term為：MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞周期。
　　5.蛋白質譜篩選出雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織表達差異1.5倍以上蛋白560個，其中79個在雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組表達上調，481個表達下調；GO分析顯著富集的Term中與腫

16、瘤相關的有：細胞外膜泡小體、Rac信號轉導、翻譯起始、細胞外基質成分等；Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相關的有：β1整合素細胞表面相互作用、Ras通路、C-MYB轉錄因子網(wǎng)絡、膠原降解等；Pathway-network分析處于中心地位的Term為：MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路。
　　6.選取出四個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關基因：ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2。Real time-PCR驗

17、證結果顯示雙歧桿菌+pET15b-CTP-NPRL2組 ANXA1表達增高約1.86倍，而TIAL1、PRMT1、ANGPTL2基因表達分別下降約1.77、2.24、19.56倍；Western blot驗證結果基本一致。
　　7.選取出差異倍數(shù)最大的ANGPTL2進行細胞生物學功能驗證，CCK-8顯示重組質粒組細胞增殖明顯增加，干擾siRNA組細胞增殖明顯減少。
　　8.FACS顯示各組細胞凋亡率分別是(10.06±0.2

18、7)%、(2.93±0.30)%、(2.99±0.11)%、(1.98±0.11)%、(3.13±0.08)%。重組質粒組與其余任意一組相比有顯著性差異(均P＜0.01)，同理干擾siRNA組；而其余三組任意兩組相比無顯著性差異(均P＞0.05)。各組處于G0/G1期的細胞比例分別是(69.32±2.45)%、(54.89±0.48)%、(54.22±2.7)%、(46.57±0.13)%、(56.05±4.29)%。重組質粒組與其余任

19、意一組相比有顯著性差異(均P＜0.01)，同理干擾siRNA組；而其余三組任意兩組相比無顯著性差異(均P＞0.05)。
　　結論：
　　1.雙歧桿菌-CTP-NPRL2能夠抑制裸鼠腎癌的生長，增加腎癌組織的凋亡并改善裸鼠體重。
　　2.雙歧桿菌-CTP-NPRL2調節(jié)了包括ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGP TL2在內的一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關基因的表達，這些基因涉及癌基因、抑癌基因、增殖與凋亡相關基因、細

20、胞周期相關基因、血管生長基因等。
　　3.ANGPTL2具有癌基因功能，過表達能夠促進腎癌細胞786-O的增殖、減少凋亡，而抑制表達則降低該細胞的增殖、增加凋亡；同時抑制ANGPTL2表達能阻滯腎癌細胞786-O細胞周期于G0/G1期，反之則結果相反。
　　4.在雙歧桿菌-CTP-NPRL2調節(jié)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的基因中，對ANGPTL2基因表達的抑制發(fā)揮了重要作用。
　　5.雙歧桿菌-CTP-NPRL2可能主要