重組人腫瘤壞死因子α聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討rhTNF-α聯(lián)合紫杉醇對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞的抑制增殖作用、作用機(jī)制以及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期為化療與生物治療聯(lián)合應(yīng)用治療腺樣囊性癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 1.研究材料 1.1.實(shí)驗(yàn)材料：人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系(SACC-83)、新生鼠肺成纖維細(xì)胞(L929)。 1.2.藥品：重組人腫瘤壞死因子α(rhTNF-α)、紫杉醇(paclitaxel)。 1.3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新

2、生Balb/c乳鼠。 2.方法： 2.1.細(xì)胞培養(yǎng)：取人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(SACC-83)按常規(guī)貼壁細(xì)胞法于RPMI1640培養(yǎng)液中(含胎牛血清及雙抗)在5％CO237℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)原代培養(yǎng)鼠肺成纖維細(xì)胞(L929)作為對(duì)照。 2.2.實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)不同藥物濃度分為9組，藥物作用72h。①對(duì)照組：加入不含藥物的培養(yǎng)液；②T組：rhTNF-α終濃度為150U/ml；③T'組

3、：rhTNF-α終濃度為：1500U/ml：④P組：紫杉醇的終濃度為0.0365μg/ml；⑤P'組：紫杉醇的終濃度為0.365μg/ml；⑥T+P組：含有終濃度rhTNF-α150U/ml和紫杉醇0.0365μg/ml；⑦T+P'組：含有終濃度rhTNF-α150U/ml和紫杉醇0.365μg/ml；⑧T'+P組：含有終濃度rhTNF-α1500U/ml和紫杉醇0.0365μg/ml：⑨T'+P'組：含有終濃度rhTNF-α1500U

4、/ml和紫杉醇0.365μg/ml； 2.3.檢測(cè)：①M(fèi)TT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡率及細(xì)胞周期改變。③光鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。④在電鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 研究結(jié)果： 1.形態(tài)學(xué)觀察： 1.1.SACC-83細(xì)胞單層生長(zhǎng)，胞體較大，呈上皮樣多角形鑲嵌狀排列，可見(jiàn)較多核分裂像。加入TNF-α72h后，SACC-83細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞大多呈梭形或細(xì)長(zhǎng)形，類(lèi)似于成纖維細(xì)胞，形態(tài)相

5、對(duì)規(guī)則，核漿比例減小。細(xì)胞堆集生長(zhǎng)現(xiàn)象減少，大多散在生長(zhǎng)，呈放射狀、漩渦狀分布，多邊形鑲嵌樣生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸消失。 1.2.L929細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈漩渦狀分布。細(xì)胞體呈梭形，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。 2.MTT法： 2.1.SACC-83細(xì)胞：細(xì)胞增殖抑制率T組為23.54％，T'組為22.41％，P組為41.42％，P'組為48.26％，T+P組為55.68％，T+P'組為57.86％，T'+P組為55

6、.19％，T'+P'組為62.72％。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。 2.2.L929細(xì)胞：細(xì)胞增殖抑制率T組為-0.98％，T'組為-8.06％，P組為17.44％，P'組為26.83％，T+P組為3.90％，T+P'組為21.26％，T'+P組為-0.61％，T'+P'組為20.96％。L929細(xì)胞各組的細(xì)胞增殖抑制率顯著低于SACC-83細(xì)胞(P＜0.05)。 3.光鏡下觀察：腫瘤細(xì)

7、胞圓形、多邊形，胞核圓形，居中，核分裂象易見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)組中可見(jiàn)部分SACC-83細(xì)胞及細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)濃縮或邊集，成塊狀或新月?tīng)?，胞漿固縮。對(duì)照組的SACC-83細(xì)胞成片排列，細(xì)胞質(zhì)及核染色質(zhì)均勻，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。 4.透射電鏡觀察：可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的SACC-83出現(xiàn)：細(xì)胞皺縮，胞體、胞核縮小，細(xì)胞表面纖毛喪失，染色質(zhì)固縮，呈塊狀或顆粒邊集于核膜內(nèi)側(cè)，電子密度增高，亦可見(jiàn)凋亡小體。對(duì)照組的SACC-83細(xì)胞成片排列，偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。

8、 5.流式細(xì)胞儀分析： 5.1凋亡率：檢測(cè)SACC-83細(xì)胞各組均有凋亡峰形成。其中對(duì)照組的凋亡率為3.90±0.40％，T組凋亡率為2.25±0.45％，T'組凋亡率為2.63±0.48％；P組凋亡率為12.17±1.92％，P'組凋亡率為16.12±2.03％；T+P組凋亡率為15.60土2.20％，T+P'組凋亡率為21.63±2.11％，T'+P組凋亡率為16.43±1.98％，T'+P'組凋亡率為25.25±4.

9、35％。T+P'組與T'+P'組的細(xì)胞凋亡率高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。L929細(xì)胞各組無(wú)凋亡峰形成，其中對(duì)照組的凋亡率為0.83±0.08％，T組凋亡率為0.43±0.09％，T'組凋亡率為2.51±0.45％；P組凋亡率為3.03±1.02％，P'組凋亡率為1.57±0.85％；T+P組凋亡率為1.38±0.63％，T+P'細(xì)凋亡率為2.45±1.08％，T'+P組凋亡率為2.06±0.52％，T'+P'組凋亡率為2.44±1.

10、85％。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，組間兩兩比較亦無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 5.2細(xì)胞周期：SACC-83細(xì)胞加入紫杉醇的實(shí)驗(yàn)組G2M期細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組發(fā)生了明顯的增多(P＜0.05)：P組G2M期細(xì)胞數(shù)占34.10±3.30％，P'組G2M期細(xì)胞數(shù)占41.77±7.70％，T+P組G2M期細(xì)胞數(shù)占44.57±8.18％，T+P'組G2M期細(xì)胞數(shù)占45.57±6.52％，T'+P組G2M期細(xì)胞

11、數(shù)占44.70±4.25％，T'+P'組G2M期細(xì)胞數(shù)占47.03±2.40％；T組、T'組的G2M期細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。聯(lián)合用藥組的G2M期細(xì)胞數(shù)比紫杉醇組有增多的趨勢(shì)(P＞0.05)。L929細(xì)胞中加入紫杉醇的實(shí)驗(yàn)組G2M期細(xì)胞較對(duì)照組與T組、T'組G2M期細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)紫杉醇組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 研究 結(jié)論： 1.TNF-α可以抑制SACC-83細(xì)胞增