重組人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體的表達(dá)、分離純化及其生物活性研究.pdf

1、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand，Apo2L)，是1995年發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員。無(wú)論在體內(nèi)還是體外，可溶形式TRAIL均可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。人全長(zhǎng)的TRAIL分子由281個(gè)氨基酸組成，屬Ⅱ型跨膜蛋白，包括胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和胞膜外區(qū)，分子量為32.5kD，等電點(diǎn)為7.63。TRAIL分子在第114位～

2、281位氨基酸為可溶性肽段，可通過(guò)一個(gè)鋅離子形成活性最強(qiáng)的同源三聚體結(jié)構(gòu)。 TRAIL是通過(guò)與其細(xì)胞膜受體結(jié)合發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡作用的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種：TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1)、TRAIL-R4(DcR2)和護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)。TRAIL與死亡受體結(jié)合可以激活線粒體依賴和非線粒體依賴兩條細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，介導(dǎo)死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入

3、細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)效應(yīng)酶胱天蛋白酶3(caspase-3)，最終引起腫瘤細(xì)胞凋亡。與TNF家族其它成員相比，TRAIL具有可選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊發(fā)展前景的抗腫瘤藥物，從2000年以來(lái)，一直受到國(guó)內(nèi)許多研究者的廣泛關(guān)注。 最近，本實(shí)驗(yàn)室利用pET-23d(+)質(zhì)粒做為表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)TRAIL<,114-281>蛋白的原核表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)利用以上表達(dá)載體，對(duì)TRAIL<,11

4、4-281>蛋白的表達(dá)、純化及抗腫瘤活性等方面進(jìn)行了研究。我們選擇大腸桿菌w3110做為目標(biāo)蛋白表達(dá)的宿主菌，利用常規(guī)方法用我室構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-23d(+)/TRAIL<,114～281>轉(zhuǎn)化E.coli w3110感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取后，酶切鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果。為了使目標(biāo)蛋白在宿主菌中獲得高效表達(dá)，我們?cè)趽u瓶條件下進(jìn)行了培養(yǎng)基成分(包括培養(yǎng)基類型、碳源、氮源成分和重要金屬離子)的優(yōu)化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，最終確定的發(fā)

5、酵條件可使TRAIL蛋白得到高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的50％，可溶形式占上清20％左右，產(chǎn)量約75mg/L?？扇懿糠窒群笸ㄟ^(guò)兩步離子交換層析純化后，純品蛋白利用RP-HPLC檢測(cè)純度達(dá)到96％。利用MTT法初步檢測(cè)純化蛋白的體外抗腫瘤活性，選擇SMMC7721、K562、A549和KB<,v200>四種腫瘤細(xì)胞系，考察重組TRAIL蛋白對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的劑量范圍內(nèi)，重組目標(biāo)蛋白對(duì)SMMC7721、K562、