腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、浙江大學碩士學位論文腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究姓名：周慧明申請學位級別：碩士專業(yè)：內科學（傳染病學）指導教師：陳智2003.5.1浙江大學碩士學位論文胎牛血清的培養(yǎng)液至I ∞“I 培養(yǎng)1 2 小時后，吸去上清后加1 0 0 “l(fā) 的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1 2小時后加不同濃度的T R A I L ( 5 0 n g ／m l ，l O O n g ／m l ，2 0 0 n g ／m l ，4 0 0 n g ／

2、m l ，8 0 0 n g ／m l ，1 6 0 0 n g ／m 1 ) 及其選擇合適的劑量與亞毒性劑量的化療藥( 阿霉素0 ．1 U g ／m l ，絲裂霉素l 腿／m 1 及5 一F U0 ．1 p 。g ／m 1 ) 聯(lián)合應用，C a s p a s e - 9 抑制劑( 2 0 P M ) 和拉米夫定0 ．2 1 1 9 ／1 ，用無血清的培養(yǎng)液加至1 0 0 “l(fā) ，培養(yǎng)1 8 小時后加入2 0 P - 1 的M T T

3、 ，與M T T 共孵育4 小時后0 ．D 5 7 0 r m 檢測。酶標儀上測出0 ．D 5 7 0 n m 值，細胞殺傷率= [ ( 卜實驗組光吸收值／對照組光吸收值) ] X 1 0 0 ，重復三次，得出量效關系曲線。2 ) 凋亡分析：使用c A L T A GL a b o r a t o r i e s 公司A n n e x i n V 試劑盒檢測。2 m I 培養(yǎng)液含有4 x i 0 5 細胞培養(yǎng)于1 2 孔板，加含有1

4、0 ％胎牛血清的培養(yǎng)液至1 0 0 ul 培養(yǎng)1 2小時后，吸去培養(yǎng)液加1 0 0 “l(fā) 的無血清1 6 4 0 培養(yǎng)液培養(yǎng)】2 小時后加不同濃度T R A I L( 0 ，5 0 n g ／m l ，l O O n g ／m l ，2 0 0 n g ／m l ，4 0 0 n g ／m l ，8 0 0 n g ／m l ，1 6 0 0 n g ／m 1 ) 及其選擇合適的劑量與亞毒性劑量的化療藥( 阿霉素0 ．1 №／m l ，

5、絲裂霉素I P - g ／m l 及5 一F U0 ．1 l | t g ／m I ) 聯(lián)合應用，用無血清的培養(yǎng)液加至2 m l ，1 2 小時后，采用流式細胞儀( F c M ) A n n e x i n V - F I T C 和碘化丙啶( P I )熒光染色分析其誘導凋亡活性，碘化丙啶( P I ) 和A n n e x i n V 均陰性為活細胞，P I 陰性，A n n e x i nV 陽性為早期凋亡細胞，碘化丙啶( P

6、I ) 和A n n e x i n V 均陽性為晚期凋亡細胞。3 ) 藥物抑制實驗：1 x 1 0 3 ／m l H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞接種2 4 孔細胞培養(yǎng)板，每孔i m l ，3 7 “ ( 2 、5 ％C 0 2 飽和濕度的條件下培養(yǎng)2 4 h ，加入0 ．2 1 1 9 ／1 拉米夫定，同時設細胞對照，每2 4 h 換原濃度藥液及對照培養(yǎng)液一次t 3 d 后收集培養(yǎng)液，一2 0 “ C 冰凍保存待測。4 )

7、抗原抑制實驗：用H B e A g 和t l B s A g 固相放射免疫檢測試劑盒測定H B e A g 和H B s A g 的滴度。測定每孔c p m 值，三個平行孔取均值后，計算抑制率?？乖种坡? ％) = [ ( 細胞對照c p m 值一給藥組c D m 值) ／細胞對照c p m 值] ×1 0 0 。5 ) H B VD N A 檢測：加入拉米夫定及對照的H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞的上清液經(jīng)深圳匹

8、基公司H B VD N A熒光定量試劑盒抽提后，用R o c h e 公司的L i g h t c y c l e 熒光定量儀檢測D N A 的拷貝數(shù)。6 ) 統(tǒng)計分析：細胞活性分析采用非線性模型，卡方檢驗得出P 值，所有實驗結果均采用S P S S1 0 ．0 統(tǒng)計軟件，進行統(tǒng)計分析。結果：1 lT R A I L 誘導細胞株的凋亡：人重組T R A I L 對肝癌細胞株及人正常肝細胞L 0 2殺傷的量一效關系成正比，T R A I

9、L I O O n g ·m l 。殺傷率約1 0 ％。1 6 0 0 r i g ·m 1 1 殺傷率為6 5 牝A 上。而轉染H B V 的H e p 6 2 ．2 ．1 5 細胞，加入不周濃度的T R A I L 后，殺傷率維持在1 0 ％左右，而肝癌細胞／- ／e p G 2 在不同濃度的T R A I L 的作用下，T R A I L 2 0 0 n g ／m l 可見凋亡峰，凋亡率為1 8 ．8 3 ％，