腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體在原發(fā)性膽汁性肝硬化肝損傷中的作用研究.pdf

1、本文應(yīng)用熒光染色分析線粒體損傷情況，并用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)bd-2分子的表達(dá)情況，以初步闡明TRAIL在PBC肝損傷中的作用。 第一部分原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血TRAIL表達(dá)的測(cè)定及臨床意義。 本部分研究目的是通過檢測(cè)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TRAIL基因及膜型、可溶型蛋白水平的表達(dá)變化，探討TRAIL的表達(dá)與PBC的相關(guān)性?；赥aqMan-MGB熒光探針技術(shù)，自行建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法

2、，檢測(cè)30例PBC患者、25例慢性肝炎肝硬化患者及30例健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞TRAIL mRNA的含量；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)上膜型TRAIL蛋白的表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附術(shù)(ELISA)檢測(cè)外周血sTRAIL及TNF-α濃度，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定所有入選者γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)和堿性磷酸酶(ALP)水平。 結(jié)果顯示： 1)PBC和慢性肝炎肝硬化患者PBMC中TRAIL mRNA的表達(dá)量均顯著

3、高于健康對(duì)照組((0.5±0.2)×10<'5>拷貝/μ gRNA)(P<0.01)，PBC患者約為健康個(gè)體的6.6倍，而慢性肝炎肝硬化患者約為4.2倍；兩組之間TRAIL mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 2)膜型TRAIL蛋白在正常人外周血細(xì)胞幾乎無表達(dá)，而PBC患者和慢性肝炎肝硬化患者外周血各群細(xì)胞，尤其單核細(xì)胞上TRAIL陽性表達(dá)率明顯高于健康對(duì)照(P<0.01)； 3)PBC及慢性肝炎肝硬化患

4、者血漿sTRAIL明顯高于健康個(gè)體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 4)TRAIL在外周血的表達(dá)以可溶形式為主，且TRAIL基因、蛋白水平的改變無疾病特異性，肝炎病毒或各種免疫損傷等多種因素都可能導(dǎo)致TRAIL的升高。 5)PBC和肝炎肝硬化患者血漿TNF-α、GGT和ALP濃度均明顯高于健康對(duì)照，但PBC患者GGT和ALP水平升高更為顯著，且PBC患者血漿sTRAIL與TNF-α、GGT、ALP的濃度成正相關(guān)，而肝

5、炎肝硬化患者血漿sTRAIL與GGT、ALP無顯著相關(guān)性，提示PBC患者膽汁淤積以及膽管細(xì)胞和(或)門管區(qū)肝細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度與sTRAIL的異常表達(dá)相關(guān)； 6)PBC患者血漿sTRAIL與TRAIL基因表達(dá)亦具有顯著相關(guān)性(P<0.01)。 上述結(jié)果表明，TRAIL在PBC患者外周血的表達(dá)異常增高，這種異常表達(dá)與PBC的發(fā)生和嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此TRAIL可能在PBC的發(fā)病中具有一定作用。 第二部分TRAIL

6、和/或膽汁誘導(dǎo)正常人肝細(xì)胞凋亡研究。 通過體外培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞(張氏肝細(xì)胞)，與不同濃度的TRAIL蛋白和/或膽汁作用，在不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用MTT法觀察對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，PI染色法檢測(cè)DNA含量及細(xì)胞周期分析，Annexin V/PI法檢測(cè)早晚期凋亡細(xì)胞，熒光染色分析線粒體損傷情況，并用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)bcl-2分子的表達(dá)，以初步闡明TRAIL在PBC肝損傷中的作用。體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞株(張氏肝細(xì)胞)，經(jīng)終濃度分別為

7、4、20、100ng/ml的TRAIL或10，20，40 μl/ml膽汁或10 μl/ml膽汁配伍4，20，100ng/mlTRAIL刺激后，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、早晚期凋亡及線粒體損傷情況，并分析細(xì)胞內(nèi)bcl-2分子的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示： 1)低濃度TRAIL(4ng/ml)組0D值與對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明低濃度TRAIL對(duì)肝細(xì)胞抑制作用不明顯。20 ng/ml及100 n

8、g/ml TRAIL作用3d后對(duì)肝細(xì)胞有顯著的抑制作用，OD值與對(duì)照組(0.992±0.068)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10 μl/ml及20 μl/ml膽汁組作用2d，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而3d后對(duì)肝細(xì)胞有明顯的生長抑制作用(P<0.05)；40 μl/ml膽汁組于2d即有明顯抑制作用；10 μl/ml膽汁配伍100ng/mlTRAIL時(shí)，較單獨(dú)加TRAIL或膽汁，抑制作用更明顯。 2)各濃度TRAIL和/或膽汁

9、與張氏肝細(xì)胞共培養(yǎng)2天后換液，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長抑制率明顯降低。 3)100ng/mlTRAIL作用于肝細(xì)胞不同時(shí)間，與對(duì)照組相比，G0/G1期比例均有升高趨勢(shì)，S期比例下降，在48h和72h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，增殖指數(shù)在48h及72h明顯下降；10μl/ml膽汁配伍100ng/mlTRAIL作用48h及72h出現(xiàn)G0/G1期比例明顯升高，S期比例下降，且比單獨(dú)作用影響更明顯。 4)20，100ng/mlTRAIL或

10、40μl/ml膽汁或膽汁配伍TRAIL作用24h誘導(dǎo)肝細(xì)胞早期凋亡率比對(duì)照組((4.4±0.4)％)顯著增加(P<0.05)；作用48h后，20、100ng/mlTRAIL及20、40μl/ml膽汁組晚期凋亡率分別為(9.1±2.6)％、(10.7±2.5)％及(6.6±1.2)％、(12.7±3.2)％，與對(duì)照組((3.8±0.2)％)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10μl/ml膽汁配伍20ng/ml及100ng/mlTRA

11、IL晚期凋亡率亦明顯增高。 5)各濃度TRAIL作用12h后熒光強(qiáng)度即有明顯降低，檢測(cè)波峰左移；10μl/ml膽汁配伍不同濃度TRAIL均較單獨(dú)膽汁作用，熒光強(qiáng)度更低，表明線粒體損傷更重。 6)肝細(xì)胞與100ng/ml TRAIL，10 μl/ml膽汁及10 μl/ml膽汁配伍100ng/mlTRAIL分別作用12h后，對(duì)照組積分光密度值較實(shí)驗(yàn)各組均明顯增高(P<0.01)，且單獨(dú)TRAIL和膽汁組分別比膽汁配伍TRAI