腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子在骨關節(jié)炎形成機制中作用的實驗研究.pdf

1、背景：
　　骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最常見的關節(jié)疾病之一，在老年人中發(fā)病率較高。主要表現(xiàn)為骨關節(jié)的慢性、退行性改變。在全世界范圍內，OA的患病率居首位。在我國，隨著人口老齡化日益加重，OA的發(fā)病率逐年上升。OA是力學和生物學因素作用下導致軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨降解與合成耦聯(lián)失平衡所致。長期以來對于OA病因的研究側重于生物力學的改變，因為單生物力學因素不能完全解釋OA的發(fā)病機理，近幾年側重點有所改變，

2、著重于酶學、炎性細胞因子和細胞凋亡等。
　　現(xiàn)有的研究表明，OA的主要病理機制是在炎性細胞因子介導下，致病因素促進各種蛋白酶在關節(jié)軟骨和滑膜中的表達增高，降解關節(jié)軟骨基質中膠原纖維網(wǎng)和蛋白多糖，促使關節(jié)軟骨的退行性改變。有很多炎性細胞因子及趨化因子等參與了蛋白酶的調控。其中最重要的是IL-1β和TNF-α，它們不僅在炎癥反應過程中起主導作用，在OA中它們更主要的功能是上調基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinas

3、es，MMPs)的表達，增加MMPs的活性。既然IL-1β和TNF-α在OA中扮演著重要的角色，能否通過抑制這兩種因子來控制OA?但是臨床試驗結果顯示，抑制IL-1β和TNF-α并沒有在OA病人中出現(xiàn)理想的效果。我們認為這可能源于OA中存在更多的各種致病因子及它們之間復雜的相互作用，當然還包括許多我們未知的因子。這些細胞因子相互協(xié)調，相互作用，刺激MMPs的合成與分泌，最后促進軟骨組織的降解。
　　腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(t

4、umor necrosis factor-like weakinducer of apoptosis，TWEAK)是一種屬TNF配體超家族成員(tumor necrosisfactor superfamily，TNFSF)的細胞因子，能微弱誘導腫瘤細胞凋亡而由此命名。更多研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK可在多種細胞上表達，是一種多功能的細胞因子，它不僅可誘導細胞凋亡，而且具有促進炎性細胞因子和趨化因子分泌及細胞增生等生物學效應，還能特異性抑制軟骨形

5、成，從而阻礙軟骨的內源性修復。成纖維細胞生長因子誘導因子14(fibroblast growth factor inducible14，F(xiàn)n14)是一種TWEAK受體，廣泛表達于多種組織，可通過連接不同的含有TNF受體相關因子(TNFreceptor-associated factor，TRAF)結構域的受體蛋白或胞漿蛋白，啟動細胞內的一系列信號轉導途徑。證據(jù)表明，TWEAK是類似于IL-1β和TNF-α的多功能細胞因子，它是否也協(xié)同參

6、與了關節(jié)軟骨降解的演變過程？TWEAK及其受體Fn14是否也在OA中扮演了一定的角色？
　　本研究擬通過大鼠OA模型檢測TWEAK及其受體Fn14 mRNA及蛋白在病變關節(jié)軟骨及滑膜組織中的表達情況，及TWEAK對體外培養(yǎng)的軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞產(chǎn)生炎性細胞因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶的影響情況，擬對TWEAK及其受體Fn14在OA發(fā)病機制中的作用有初步的認識，為探索OA治療新方案提供理論依據(jù)。
　　第一部分大鼠骨關節(jié)

7、炎模型的建立及評價
　　目的：制作大鼠膝關節(jié)OA模型，并進行大體及光鏡下的觀察及組織學評價，為后續(xù)實驗做準備。
　　材料與方法：用前交叉韌帶切斷術(anterior cruciate ligamenttransaction，ACLT)制作大鼠膝關節(jié)OA模型，假手術組及正常組作為對照。在術后1周、2周及4周觀察膝關節(jié)退變的大體改變，光鏡下觀察軟骨的組織學改變，并用Mankin評分系統(tǒng)評分。
　　結果：不同時間段實驗組膝關

8、節(jié)大體及光鏡下均觀察到OA特征性的退行性改變，且隨時間延長而逐漸加重，符合整個OA的病理發(fā)展過程，且代表了OA的早中期，有利于后續(xù)的分子生物學檢測。
　　結論：我們用ACLT制作的大鼠膝關節(jié)OA模型，造模效果確切穩(wěn)定，為后續(xù)實驗的可靠性打好了基礎。
　　第二部分 TWEAK及其受體Fn14在大鼠骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨和滑膜中的表達
　　目的：檢測大鼠膝關節(jié)OA模型中軟骨及滑膜組織TWEAK及其受體Fn14mRNA及蛋白的表達

9、情況，及關節(jié)液中TWEAK的濃度變化。
　　材料與方法：制作大鼠膝關節(jié)OA模型，用假于術組及正常組作為對照。在術后第1周、第2周及第4周后收集軟骨組織、滑膜組織及關節(jié)液。實時定量PCR(Real-time PCR)檢測TWEAK及其受體Fn14 mRNA的表達;蛋白質免疫印跡法(Western-blot)檢測TWEAK及其受體Fn14蛋白的表達;酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay

10、，ELISA)檢測關節(jié)液中TWEAK的濃度變化。
　　結果：OA模型組滑膜組織中TWEAK及其受體Fn14 mRNA和蛋白的表達在造模后第2及第4周均高于假手術組及正常對照組;OA模型組軟骨組織中TWEAK及其受體Fn14 mRNA和蛋白的表達在造模后第2周高于假手術組及正常對照組;OA模型組關節(jié)液中TWEAK的濃度在造模后第1周、第2周及第3周均高于假手術組及正常對照組。
　　結論：大鼠膝關節(jié)OA模型中，關節(jié)軟骨及滑膜組織

11、中TWEAK及其受體Fn14mRNA及蛋白的表達在病程的部分時段明顯升高，且關節(jié)液中TWEAK的濃度也持續(xù)增高，它們與OA的病理過程有著緊密的關聯(lián)。
　　第三部分 TWEAK對體外培養(yǎng)的軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞產(chǎn)生炎性細胞因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶的影響
　　目的：檢測TWEAK對體外培養(yǎng)的軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞產(chǎn)生炎性細胞因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶的影響
　　材料與方法：使用Wistar大鼠，取正常關節(jié)

12、軟骨及滑膜組織，培養(yǎng)軟骨細胞及成纖維樣滑膜細胞并鑒定，使用TWEAK刺激軟骨細胞及成纖維樣滑膜細胞，收集刺激后24小時、48小時及72小時后的上清液，ELISA法測定上清液中的下列成份:①基質金屬蛋白酶（MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13）;②炎性細胞因子(IL一1β、IL-6、TNF-α);③趨化因子(RANTES、MCP-1、MIP-2、IL-8)。
　　結果：TWEAK刺激后軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞產(chǎn)生基質金

13、屬蛋白酶（MMP-1、MMP-3、MMP-9）、炎性細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和趨化因子(RANTES、MCP-1、IL8)顯著增加;但MIP-2的產(chǎn)生在兩種細胞中均顯著減少;MMP-13僅在軟骨細胞中的產(chǎn)生顯著增加，而在成纖維樣滑膜細胞中無變化。且增加的程度大多與刺激的時間呈正相關，僅MIP-2呈負相關;但軟骨細胞在TWEAK的刺激下，產(chǎn)生MCP-1、IL-8、MMP-3和MMP13的量沒有隨著時間的延長而增加;成纖