人腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　人腫瘤壞死因子α(hTNFα)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）病程中起著刺激和放大炎癥的關(guān)鍵作用，藥物阻斷其活性可有效緩解RA病情，是RA治療中重要的藥物靶點。本研究通過構(gòu)建hTNFα轉(zhuǎn)基因小鼠，并從臨床癥狀、病理特征和細(xì)胞因子檢測等方面系統(tǒng)性地對轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的表型進(jìn)行評價，篩選獲得具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床特征的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用該模型對臨床前（AT132）和市售（Adalimumab和Infliximab）的

2、hTNFα單抗藥物以及化學(xué)合成藥物（鹽酸青藤堿）開展藥效學(xué)評價實驗，為該hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎新藥篩選提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　利用重組hTNFα/β-球蛋白（globin）轉(zhuǎn)基因載體，獲得hTNFα轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，通過定期對該小鼠體重和關(guān)節(jié)炎臨床癥狀進(jìn)行評價；觀察小鼠病程發(fā)展過程中關(guān)節(jié)組織和器官病理改變；hTNFα在小鼠關(guān)節(jié)組織及器官中的免疫組織化學(xué)表達(dá)定位；對小鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜中hTNFα、IL

3、-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、mTNFα、IFNγ和GM-CSF等細(xì)胞因子進(jìn)行流式細(xì)胞定量分析，最終篩選獲得具有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床特征的hTNFα轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
　　應(yīng)用該模型，通過臨床觀察、病理檢測以及hTNFα定量分析，對臨床前（AT132）和市售（Adalimumab和Infliximab）的hTNFα單抗藥物以及化學(xué)合成藥物（鹽酸青藤堿）開展抗RA藥效學(xué)評

4、價實驗、抗RA量效分析等實驗，為該hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎新藥篩選提供實驗依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.建立hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型。通過基因組PCR鑒定得到的FVB背景hTNFα轉(zhuǎn)基因陽性小鼠均表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎癥狀。體重：較FVB近交系小鼠，在出生后4~18周的觀察期內(nèi)，hTNFα轉(zhuǎn)基因小鼠體重增長緩慢。臨床癥狀：隨年齡增長，hTNFα轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹變形，握力下降，整體靈活性減低，關(guān)節(jié)僵硬，活動

5、嚴(yán)重受損等關(guān)節(jié)炎相關(guān)的臨床癥狀。病理特征：hTNFα轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)在膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)和腕關(guān)節(jié)等多個關(guān)節(jié)出現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理改變，主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞的浸潤，滑膜增生，血管翳和破骨細(xì)胞的出現(xiàn)，滑膜細(xì)胞纖維化，最終導(dǎo)致軟骨和骨的破壞。而其他組織器官未見異常。hTNFα免疫組化定位：關(guān)節(jié)滑膜組織異常高表達(dá)hTNFα，同時，其他部分組織器官中也存在hTNFα陽性反應(yīng)。細(xì)胞因子檢測：與WT鼠比較，hTNFα轉(zhuǎn)基因鼠關(guān)節(jié)滑膜中 hTNFα表達(dá)異常升

6、高(p<0.01)，血清中hTNFα以及血清和關(guān)節(jié)滑膜中的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、鼠源TNFα、IFNγ和GM-CSF表達(dá)未見顯著差異。
　　2. hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型應(yīng)用。AT132：抗hTNFα單抗藥物ΑT132(30 mg/kg)治療hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠10周，hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠癥狀被抑制，關(guān)節(jié)滑膜組織中hTNFα表達(dá)量顯著降

7、低，藥物治療有效。對AT132進(jìn)行量效關(guān)系評價后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥劑量為1.25mg/kg和0.625mg/kg時仍能表現(xiàn)很好的臨床治療效果，當(dāng)給藥劑量降低到0.312mg/kg和0.156 mg/kg時，AT132治療無效。實驗結(jié)果表明，對hTNFα小鼠有效的ΑT132給藥劑量為≥0.625mg/kg。Adalimumab：不同濃度抗hTNFα單抗藥Adalimumab(12mg/kg、6mg/kg、3mg/kg)治療hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎

8、小鼠8周，hTNFα小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀均被抑制，關(guān)節(jié)滑膜組織中hTNFα表達(dá)量顯著降低，藥物治療有效。Infliximab：不同濃度抗hTNFα單抗藥Infliximab(60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg)治療hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠8周，hTNFα小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀均被抑制，關(guān)節(jié)滑膜組織中hTNFα表達(dá)量顯著降低，藥物治療有效。.鹽酸青藤堿：藥物治療hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠4周，hTNFα小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀未被抑制，關(guān)節(jié)滑膜組織

9、中hTNFα表達(dá)量無顯著差異，該小鼠對青藤堿治療不敏感。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型，并獲得了該模型在體重、臨床表現(xiàn)、病理特征、細(xì)胞因子水平等與關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的重要表型指標(biāo)，為模型應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　2.利用該模型，系統(tǒng)地對臨床前hTNFα單抗藥物AT132進(jìn)行了系統(tǒng)地藥效學(xué)和量效關(guān)系評價，發(fā)現(xiàn)AT132（(30 mg/kg)）治療hTNFα轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠有效，且最低起效濃度為0.