獼猴川西亞種腫瘤壞死因子α基因的克隆及表達.pdf

1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一種強效的細胞因子,在參與免疫反應、炎癥、損傷反應、控制細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡均能發(fā)揮作用。TNF-α及其抑制劑對于多種疾病的早期診斷、預后判斷和治療方面都有重要作用。獼猴川西亞種已用于多種人類重大疾病非人靈長類模型的構(gòu)建，是研究TNF-α生物制劑對多種痰病影響的高價值實驗動物。到目前為止，TNF-α在人和其他動物方面研究較多，但對獼猴TNF-

2、α的研究較少，國內(nèi)還未見獼猴川西亞種（Macaca mulatta lasiotis，Mm）TNF-α克隆表達的相關(guān)報道。本研究通過基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α，并構(gòu)建MmTNF-α基因的原核和真核表達菌株，并進行表達，為深入研究MmTNF-α蛋白活性功能、結(jié)構(gòu)功能、制備單克隆抗體、開發(fā)檢測試劑盒奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，也為保護獼猴川西亞種提供資料。
　　1、獼猴川西亞種TNF-α基因的克隆與原核表達
　　參照NCBI/GenBan

3、k上登錄的獼猴TNF-α mRNA序列設計一對引物，利用基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α全長轉(zhuǎn)錄本為模板，PCR擴增目的基因，將其定向插入pMD-19T上，構(gòu)建重組菌DH5α/pMD-19T-MmTNF-α，隨機挑取陽性重組子進行PCR鑒定及序列測定分析。擴增獲得的MmTNF-α基因為702 bp，測序結(jié)果和GenBank上發(fā)布的獼猴TNF-α序列(NCBI Reference Sequence: NM_001047149.1)比對，同源

4、性為99％。
　　根據(jù)測序成功的MmTNF-α基因序列設計合成一對表達引物，經(jīng)亞克隆構(gòu)建原核表達載體pGEX-4T-1-MmTNF-α，進行PCR、雙酶切鑒定，并在E.coliBL21(DE3)中進行表達。在37℃下，0.1mmol/L IPTG誘導表達原核表達菌株E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-MmTNF-α4 h，獲得大小約為52 kDa且主要以包涵體形式存在的融合蛋白，與預期大小一致，經(jīng)過WB分析證實重組

5、蛋白具有良好免疫反應性。
　　2、獼猴川西亞種TNF-α真核表達載體的構(gòu)建與表達
　　將實驗室克隆的MmTNF-α基因插入pPIC9K多克隆位點，Sal I線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-MmTNF-α，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化GS115。PCR鑒定陽性克隆，用PCR、MM和MD平板進行轉(zhuǎn)化子表型鑒定，G418梯度平板篩選高拷貝重組菌。重組菌pPIC9K-MmTNF-α/GS115利用甲醇誘導，SDS-PAGE和Western-blot分析表