CHO細(xì)胞表達(dá)人腫瘤壞死因子受體Ⅱ-Fc融合蛋白研究.pdf

1、哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)體系顯示了較大優(yōu)越性。其中，二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型的中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞(CHO/DHFR-)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。 在CHO/DHFR-表達(dá)系統(tǒng)中，應(yīng)用弱化DHFR基因(選擇基因)表達(dá)水平的原理來提高腫瘤壞死因子受體Ⅱ胞外區(qū)—人免疫球蛋白IgGFc(TNFR-Fc)融合蛋白分子的表達(dá)水平。為此，構(gòu)建了二種可擴增雙順反子表達(dá)載體。二種表達(dá)載體只是DHFR基因插入IRES序列之后的位置不同。 轉(zhuǎn)

2、染CHO/DHFR-細(xì)胞后，陽性克隆基因組中TNFR-Fc基因檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒已整合到CHO基因組里。在隨后通過RT-PCR方法對TNFR-Fc的mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測，結(jié)果表明pT-dhfr2-TRFc組的轉(zhuǎn)錄水平比pT-dhfr1-TRFc組高。對陽性克隆數(shù)及陽性克隆擴大培養(yǎng)后的表達(dá)水平進(jìn)行比較： 1、pT-dhfr1-TRFc組的克隆數(shù)為416±36個，TNFR-Fc表達(dá)水平為0.7±0.15mg/L。 2、p

3、T-dhfr2-TRFc組的克隆數(shù)為102±18個，表達(dá)水平為3.8±0.8mg/L。陽性克隆數(shù)pT-dhfr1-TRFc組高，為后者的4.08倍；pT-dhfr2-TRFc組TNFR-Fc表達(dá)水平高，為前者的5.43倍。在隨后的pT-dhfr2-TRFc組MTX加壓條件下培養(yǎng)。MTX在0；20和50nM時，TNFR-Fc表達(dá)水平分別為3.8±0.8；7.2±1.1和14.4±2.3mg/L，表達(dá)水平最高提高了3.79倍。 電泳

4、分析表明：表達(dá)產(chǎn)物TNFR-Fc分子量約為64kd(還原條件)，在非還原條件下，出現(xiàn)分子量約為128kd二聚體主帶，還出現(xiàn)了64kd單體次帶?；钚詸z測實驗顯示，表達(dá)產(chǎn)物TNFR-Fc具有中和TNF活性，能抑制TNF對L929的殺傷。 構(gòu)建的可擴增雙順反子表達(dá)載體系統(tǒng)，置于IRES前后基因(TNFR-Fc，DHFR)表達(dá)存在著不對稱性，IRES使同一mRNA中的第二個基因(DHFR)得到翻譯，利用位置效應(yīng)，降低DHFR基因的翻譯效